第三章 动、植物细胞发酵产酶.ppt

为什么大多数细胞培养需要用二氧化碳培养箱？ 　　一般细胞培养液的pH在7.0-7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统（它是人体血液中最重要的pH缓冲系统），大多数培养液用它来保持稳定的pH。用粉末配制培养液时，常常需要加入一定量的碳酸氢钠。 　　对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。　　 为什么培养的细胞要及时传代？ 体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。 四、动物细胞培养的工艺条件及其控制 种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程： 种质细胞 胰蛋白酶 悬浮细胞 悬浮培养或贴壁培养 收集培养液分离纯化 动物细胞培养工艺过程 （一）动物细胞培养基组成成分 1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6，生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。 （二）动物细胞培养基的配制 首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌，使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。 （三） 温度的控制 一般控制在36.5℃;　温度也会影响pH值。 （四）pH值的控制 一般控制在pH7.0～7.6; 培养过和需对pH值进行监测和调节； 采用CO2和NaHCO3溶液调节:需注意溶解氧的控制；流加酸碱液； 加入缓冲系统； 监测指示剂为酚酞。 （五）渗透压的控制 培养液渗透压与细胞内渗透压处于等渗状态。 （六）溶解氧的控制 溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法； 五、动物细胞培养产酶的工艺过程 以组织纤溶酶原激活剂(tPA)为例； tPA是一种丝氨酸蛋白酶,可以催化纤溶原水解生成纤溶酶;纤溶酶催化血栓中血纤维蛋白水解对血栓性疾病有显著疗效; tPA可分为tPA和uPA,国内外都应用前者. 1983年，Ｐennica,tPA转基因表达,是销售量最大的基因工程药物之一。 组织纤溶酶原激活剂 １、人黑色素瘤细胞培养基； ２、人黑色素瘤细胞培养； ３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。 第三章 动、植物细胞发酵产酶 动、植物细胞培养与微生物培养区别 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。 动植物、微生物细胞的培养比较 微生物 动物细胞 植物细胞 大 小 悬浮生长 营养要求 生长速率 代谢调节 环境敏感 细胞分化 剪切应力敏感 传统变异，筛选技术 细胞或产物浓度 1-10 可以 简单 快，倍增时间0.5-5小时 内部 不敏感 无 低 广泛使用 较高 10-100 多数细胞需附着表面才能生长 非常复杂 慢，倍增时间15-100小时 内部、激素 非常敏感 有 非常高 不常使用 低 10-100 可以，但易结团，无单个细胞 较复杂 慢，倍增时间24-74小时 内部、激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用 低 第一节 植物细胞培养产酶 从中得到最普遍而必不可少的药物有17类； 全世界用其制备天然芳香化合物的价值超过15亿＄/年； 美国用其生产药物超过30亿＄/年； 我国使用的中草药及其制备大部分来自植物。 植物来源的物质生产几乎采用提取分离法，如从木瓜中提取木瓜蛋白酶； 1902，Haberlandt提出分离植物单细胞培养成株的设想，至今已成为专门学科。 通过植物细胞产酶的进展：表3-1 目前植物细胞发酵产酶概况: 酶 植物细胞 （年份） 糖苷酶 β-半乳糖苷酶 漆酶 过氧化物酶 β-葡萄糖苷酶 酸性转化酶 碱性转化酶 糖化酶 木瓜蛋白酶 苯丙氨酸氨裂合酶 胡萝卜