创新 高效的细胞培养技术.ppt

* * * * * 抑制细胞生长的方法包括降低温度和添加化学物质（如丁酸盐），但前提是保证细胞特异性产率和产物质量。另外，降低温度的另一个优势是，蛋白水解酶的活性也降低了 低补液、低废弃，可导致营养限制 高补液、低废弃，无营养限制，提高废弃，可提高活性，但会降低活细胞密度；所以设计废弃速率时，应先决定细胞活性是否是关键因素，如果是，则应提高废弃率，以提高活性，如不是，应降低废弃，提高密度。且应考虑使细胞处于非营养限制状态，保证细胞生产，另外，应考虑培养基成本 建议起始测试废弃率设为5%，同时控制1体积反应器的补液，因有研究显示，此时活细胞密度最高，且单位体积产率可达批量模式的10倍 * CSPR过高，导致代谢饱和，持续增加不仅不会提高产物，还会导致乳酸、氨等有害产物过量累积；CSPR过低则可导致细胞凋亡 葡萄糖使用率（进样中葡萄糖和反应器中葡糖糖的浓度差）是培养基使用率的良好指标，可在葡萄糖达到特定浓度时（如CHO细胞，8.5mM；禽AGE1-CR和人CAP细胞，15mM），开始灌流；在灌流过程中，维持葡萄糖浓度，也是灌流调速调节的重要指标（如可维持葡萄糖＞1.0g/L，乳酸＜2.0g/L） 溶氧也是灌流调节的一个可用参数，如使用HeLa细胞-痘苗病毒生产HIV 囊膜衣壳蛋白gp120时，50%DO时的细胞特异性产率高于30%时的培养 哺乳动物和杂交瘤细胞培养对氨乳酸非常敏感，一般情况下，乳酸和氨的水平应始终低于生长抑制浓度（＜6mM和＜1mM） * 一般细胞培养温度控制为37℃，但在某些情况下，降低温度（如从37℃到32℃）可提高细胞特异性产率，所以可先保持细胞生长，达到稳态细胞密度后，降低温度，优化细胞产率，但降低温度可能导致过滤器滤过性下降 剪切主要发生在驱动泵和循环回路（包括中空纤维过滤器）内。一般细胞分离装置使用蠕动泵，其对管壁的挤压会造成细胞损害，磁悬浮离心泵可在一定程度上降低剪切。中空纤维过滤器内的剪切与流速、纤维内径有关：γ=4q/πR3，一般细胞可耐受2000S-1以下的应激，而较稳定的细胞系，如CHO，在3000S-1时，也不会发生显著负面影响 过滤器在长时间灌流培养中，不可避免地会发生污染，控制污染一方面可选择合适的膜材质（如低蛋白吸附的mPES）和合适的膜孔径（防止细胞或蛋白堵塞膜孔），另一方便可通过膜反向冲洗，去除膜表面积聚的凝胶污染层，ATF通过隔膜泵的周期性反复“推-拉”形成反冲，KML通过滤液泵的定时瞬时逆流形成反冲。但考虑到中空纤维内腔可能形成的负压，这种过程必需良好调控。 * 流感A病毒生产时间通常只维持48-96h，且感染性病毒在TCID50达到最大值后，很快就会降解。此外，病毒诱导的凋亡和细胞裂解会导致细胞蛋白和DNA积聚。所以，尽管HA滴度可能在延长的培养时间内保持稳定，但收获时间的选择对于活疫苗的生成和灭活疫苗的生产都至关重要。所以最佳的灌流工艺，是在最高的易感细胞浓度条件下，短而高效的病毒复制期，以获得较高的细胞特异性病毒产量。 * * * * * * * * * * 灌流工艺 其它工艺影响因素 温度：37℃有利于细胞生长，而生产时，可适当降低温度 剪切：剪切可造成细胞损害，应在保证灌流条件下，适当降低 膜污染：原因可能是膜孔颗粒性堵塞、膜吸附（疏水或静电作用）或表面凝胶层，可选择合适的中空纤维规格及定时反冲，降低污染 灌流工艺 扩展应用 培养基置换：在某些细胞培养过程中，需在特定阶段更换培养基，如含血清培养基与无血清培养基的置换、生长培养基与生产诱导培养基的置换，使用灌流模式进行，可避免置换过程中，细胞生长环境的变化，同时保证原有培养基的彻底清除。 高密度病毒感染：进行病毒生产时，为提高病毒感染时的成功率，可先将培养的宿主细胞通过灌流操作进行浓缩。 KrosFlo MagLev 切向流灌流培养系统 KrosFlo MagLev 切向流灌流培养系统 KrosFlo MagLev 切向流灌流培养系统 系统配置 磁悬浮循环进样泵（200系列） 整合式培养基补液蠕动泵及滤液流出泵，并可外接细胞废弃泵 回流自动背压控制阀 解离式中空纤维过滤器支架 外夹式超声流量计 PLC及触屏控制界面 60kg 表面声波称量单元 KrosFlo MBT 灌流流路 中空纤维过滤组件 磁悬浮泵泵头 进样压力传感器 回流压力传感器 回流管路 无菌取样断口 滤液压力传感器 滤液管路 进样管路 反应器接头 反应器接头 细胞培养液 浓缩细胞 组件COQ MBT COQ 双层无菌包装 预组装 辐照预灭菌处理 可灵活定制设计 多种不同规格选择 提供完整认证说明 KrosFlo MBT 灌流流路 KrosFlo 中空纤维组件 电镜：放大100倍 电镜：放大750倍 中空纤