病毒的血凝及血凝抑制试验.docVIP

病毒的血凝及血凝抑制试验 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂] 1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50?L 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。 3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] （一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50? 2. 于左侧第1孔加50?L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50? 3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50? 表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：?L） 孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 病毒液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0.5%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃50 结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + + - - 4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50? 3. 第１孔加被检鸡血清50?L，吹吸混合均匀，吸50?L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50?L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… 4. 自第1孔至12孔各加50? 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50? 表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：?L） 孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血清稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 病毒 对照 血清 对照 生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 被检鸡血清 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 4单位病毒 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 室温中静置 10 min 0.5%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃去50 结果观察 - - - - - - + ++ +++ ++++ ++++ - 6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。 以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。 从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。 附 录 1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液 枸橼酸钠（5H2O） 0.80g 枸橼酸（H2O） 0.055g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g 双蒸水 加至 100 ml 将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,