基因工程工具酶.ppt

单林娜 制作 Charpter 12.2 Enzymes for Molecular Cloning 基因工程工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。 这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 基因工程工具酶 12.2.1 限制性内切酶 12.2.2 甲基化酶 12.2.3 DNA连接酶 12.2.4 DNA聚合酶 12.2.5 RNA聚合酶 12.2.6 磷酸激酶和磷酸酶 12.2.7 核酸酶 12.2.8 核酶 12.2.1 限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 限制性内切酶的发现 限制性内切酶的分类 限制性内切酶的命名 限制性内切酶的活性单位 限制性内切酶的切割特点 限制性内切酶的反应条件 限制性内切酶的应用 限制性核酸内切酶的发现 E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。 仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生存，是因为E.coli B phage对λ (K)进行了修饰。 R-M系统 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。 限制性核酸内切酶的发现 1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。 限制性核酸内切酶的分类 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶的命名 限制性核酸内切酶的活性单位 50μL Buffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 buffer （pH=8.0） ： 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白) 限制性核酸内切酶的切割特点 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。 识别序列 绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。 不同核酸内切酶的特异识别位点 核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用 三种酶切末端 平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ） 同裂酶和同尾酶 同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割C CGG。 当胞嘧啶甲基化后， MspⅠ不能再切割。 同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。 BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端