水解酶和氧化还原酶组织化学原理和方法.pptVIP

胆碱酯酶 乙酰胆碱脂酶(acetycholinesterase，AchE) 水解乙酰胆碱 分布于神经元胞质内、神经与肌肉接头处（运动终板）、红细胞等，酶的检测用于追踪神经通路。 最适pH7.5~8.0 胆碱脂酶(cholinesterase，ChE) 水解胆碱的酯 见于血清、胰、唾液腺内 最适pH8.0~8.5 抑制剂 毒扁豆碱，DFP（二异丙基氟磷酸）抑制AchE和ChE 四异丙基焦磷酸酰胺特异性抑制ChE BW284C51特异性抑制AchE 方法：亚铁氰化铜法 染色原理 作用液 碘化乙酰硫代胆碱（底物） 5.0mg 0.1M顺丁烯二酸缓冲液（pH6） 6.5ml 0.1M柠檬酸钠 0.5ml 5M铁氰化钾1.0ml 30mM(0.75%)CuSO4 （捕捉剂） 1.0ml 蒸馏水（或抑制剂） 1.0ml 作用条件 温度37℃或室温；时间 30～60min 用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。 氧化还原酶 oxidoreductases 细胞的氧化还原反应主要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的 氧化还原反应是由氢的供体把氢原子转移到氢的受体的酶促反应，即脱氢酶反应 脱氢酶 脱氢酶是氧化底物，从底物将氢传递给受氢体的酶系。 不同于氧化酶，合适的受氢体不是大气中的氧，而是辅酶I、辅酶II（NDAP）或黄素蛋白，然后经氢传递系统，使受氢体还原显色，从而达到定位目的。 组化示脱氢酶分不需辅酶和必需辅酶二种。 脱氢酶的组化方法，以四唑盐和铁氰化物为受氢体 四唑盐法的基本原理 受氢体 琥珀酸脱氢酶succinate dehydrogenase，SDH 不需辅酶 琥珀酸+受氢体 ＝＝＝ 延胡索酸+还原的受氢体 方法：硝基蓝四唑法 Pearson1958 最适pH7.6~8.5 抑制剂：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制），凡与-SH基化合的作用剂皆抑制其活性。 SDH 作用液的配制： 琥珀酸钠 磷酸缓冲液 NBT（硝基蓝四唑）* DMSO（二甲亚砜） *NBT先溶于DMSO中，再加入上液 步骤： 新鲜恒冷箱切片 作用液15-35分钟，25℃ 盐水洗 Fca（氯化钙Formalin）固定10分钟 80%酒精5分钟 甘油明胶封固 结果：酶活性表现为蓝紫色沉淀 SDH仅位于线粒体中，可作为线粒体的标志酶 含SDH活性高的组织为：心肌、肾小管上皮和肝细胞 乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase,LDH 需辅酶 乳酸盐+NAD ＝＝＝丙酮酸盐+NADH+H+ 　　　　　　　　　　　 （辅酶Ⅰ） （还原型辅酶Ⅰ） 四唑盐接受还原型辅酶I的氢而被还原为深色不溶的甲 沉淀。 最适PH7.4 方法：LDH四唑盐法 LDH LDH是糖原分解的酶系 肝、骨骼肌中酶活性强 同工酶LDH1为心型，与有氧代谢有关 同工酶LDH5为肌型，与厌氧代谢有关，癌组织因糖酵解LDH5增加 过氧化物酶 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞的内质网、高尔基体等胞质颗粒中 在H2O2存在下氧化各种物质（供氢体） AH2（供氢体）+ H2O2 ─ ─→A（供氢体氧化物）+2 H2O 显示方法：DAB法 过氧化物酶 二氨基联苯胺法示过氧化物酶（Graham及Karnovsy,1966） 作用液： DAB（二氨基联苯胺） Tris-HCL缓冲液 pH7.6 新配的0.2%H2O2 步骤： 1 恒冷箱切片或涂片 2 作用3-30分钟，37℃ 3 蒸馏水洗 4 光镜直接观察 结果:酶活性处棕色。 意义：髓过氧化物酶主要分布于粒细胞和单核细胞系内，故用于区别粒系白血病与急性淋巴细胞性白血病 谢 谢！ 放映结束 感谢各位的批评指导！ 让我们共同进步 * * * * * * * 水解酶及氧化还原酶组织化学 原理及方法 水解酶 hydrolases 指催化底物发生水解反应的酶类 例如:磷酸酶类、酯酶类等 AB＋H2O AH＋BOH 酶 磷酸酶类 磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称 水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联 而显色。 碱性磷酸酶：在pH9.2-9.4表现为最大活性 酸性磷酸酶：在pH5.0显示最大活性 显示法： 金属沉淀法 偶氮耦联法 碱性磷酸酶alkaline phosphatase ,AKP、ALP 在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解。 磷酸和