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策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） P1 P2 P3 P4 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 策略之二 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。 策略之三 热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 策略之四 使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当 谢谢！ 本公司产品江苏地区特约代理 南京天为生物科技有限公司 联系电话：0258470530124小时服务热线联系人：王彤 免费技术支持：800 810 2177 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * 基因组扩增（较高灵敏度和特异性） 可编辑 可编辑 PCR常见问题、原因分析及其对策 主讲人：欧阳志荃 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 主讲内容 PCR技术简介 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当 避免反复冻融 ddH2O pH值适当 避免污染 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP ddH2O 耐热聚合酶 如何选择最合适的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性 PCR 实验的不同需求 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 长片段扩增 PCR试剂盒 扩增效率 保 真 性 特 异 性 基因组扩增、RT-PCR 基因筛选、测序、 基因克隆 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） 构建基因图谱、测序、分子遗传学 复杂模板扩增、大规模基因检测 特异性 － 热启动 Taq酶 原 理 蜡封 抗体抑制 化学修饰 特 点 避免非特异性扩增 提高PCR反应的 特异性 用 途 基因组扩增 RT-PCR － 热启动 Taq酶 特异性 产 品 类 型 产 品 名 称 产 品 性 能 化学修饰 天为时代: HotStart Taq Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start? DNA Polymerase Stratagene: SureStart? Taq 大大提高PCR反应的特异性 化学修饰不影响后续实验 抗体抑制 Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum? Taq TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 蜡封 Promega：TaqBeadTM?HotStart 保真性 — 高保真酶 原 理 用 途 3’－5’核酸 表达基