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PCR技术的原理与应用 玉门市疾病预防控制中心 地病科 变性：将作为模板的DNA链加热到95℃，使双链解旋成为单链。 引物附着：当温度下降到一个较低的温度时，加入的引物与模板链结合。 链延伸：温度再次升高到多聚酶的作用温度时，耐热的DNA多聚酶催化附着在模板链上的引物延长,成为一条新的DNA链。 PCR原理 注意事项 防止污染：专用或单独的实验室；更换手套；试剂应小份储存；吸头离心管等需洁净；尽量最后加模板等 阳性对照和阴性对照：每次实验均需包含阳性对照和阴性对照。 PCR各基本成分 Buffer： 镁离子浓度一般为1.5mM PCR反应需要由缓冲液提供一定的离子环境。镁离子浓度为1.5mM。镁离子浓度可以调节来改善PCR的质量。一般说来，降低镁离子浓度能改善特异性，而在一定范围内，升高镁离子浓度可增加灵敏度。 PCR各基本成分 引物：是PCR特异性反应的关键，引物应有特异性。 长度常为20bp左右，扩增跨度以200-500bp为宜，G+C含量以40-60%为宜，ATGC最好随机分布。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补。引物和模板之间在引物的5’侧可有个别不配对碱基。3端碱基应严格要求配对。 引物中有或能加上合适的酶切位点。 引物量： 每条引物的浓度0.1～1μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 通常配制成100μM的储存液，储存在-20℃，临用时稀释成10μM的使用液。 PCR各基本成分 模板： 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。 传统的DNA纯化方法通常用SDS和蛋白酶K处理标本。现在一般用试剂盒提取。一般检测标本，可采用快速简便的方法处理（如沸水浴等），直接用于PCR扩增。 PCR对模板浓度的要求并不严格。 PCR各基本成分 底物（dNTP)：合成DNA的原料为4种三磷酸单核苷酸。 PCR反应中使用的浓度为50～200μmol/L。一般为10 mM的混合液，可保存在-20℃。应小量分装，多次冻融会使dNTP降解。 PCR各基本成分 Taq DNA聚合酶 通常使用的酶量为2单位，酶量过多会产生非特异产物，过低则合成产物量减少。 纯水 17 μl 10x缓冲液 2.5μl dNTPs (每种2.5mM) 2 μl 上游引物（10μM） 1 μl 下游引物（10μM） 1 μl 模板或待测样品 1 μl TaqDNA多聚酶 0.5μl 典型的PCR反应（25μl ） 预变性 95 ℃ 5min 95 ℃ 1min 55 ℃ 1min 30个循环 72 ℃ 1min 延伸 72 ℃ 5min 常用PCR循环条件 PCR条件 变性温度与时间 退火温度与时间 Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 延伸温度与时间 循环次数 PCR反应特点 特异性强 灵敏度高 简单、快速 对标本的纯度要求低 PCR扩增产物的分析 凝胶电泳分析 酶切分析 分子杂交 核酸序列分析 利用PCR技术检测鼠疫菌的特异序列 选择目的基因：caf1, pla等 FI抗原：是一种糖蛋白，是鼠疫菌的特异性和保护性抗原，具有抗吞噬能力。 Pla（凝固酶和胞浆素原活化因子）：两种活性属于同一多肽，这两种活性的表达受作用时温度的控制，但与细菌生长的温度无关。28℃时，显示高度的凝固酶活性，而在37℃时，则主要显示纤溶活性。凝固酶活性主要在蚤体内形成菌栓时起作用，而纤溶活性则在37℃宿主体内起作用。 引物设计 模板的制备和处理 菌株：提取质粒或染色体DNA 标本：沸水浴 防止假阳性：用dUTP代替dTTP，实验前用尿嘧啶特异的N－糖苷酶处理标本 防止假阴性：使用内部对照 多重PCR扩增结果 结 果