实验五 底物浓度.docVIP

实验五底物浓度、酶浓度对酶促反应速度的影响 实验人：刘彦汶学号：20100331024班级：针外2010七 同组人：严安、曲畅实验日期：2012-4-25指导老师：路雪雅 实验目的 1、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验原理。 2、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验方法。 实验原理 碱性磷酸酶可以催化水解底物分子的磷酸基团。本实验用大鼠肾脏碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，水解反应如下： 水解产物苯酚与酚试剂反应呈色，产物可以在660nm波长下比色，以检测苯酚浓度，从而确定反应速度。 底物浓度对酶促反应速度的影响 当酶量不变时，增加底物浓度，在初期，反应速度显着增加，当底物浓度增加至一定量时，反应速度增加缓慢，继续增加底物浓度时，反应速度不再增加，这说明所有酶发挥了最大效用，底物的量已过剩。 将米氏方程两边取倒数所得到的双倒数方程式称林-贝氏方程： 1/V=(Km/Vmax)·1/[S]+1/Vmax 在林-贝氏方程中，1/V与1/[S]称线性关系。以1/V对1/[S]作图得到一条直线，其斜率是Km/Vmax，在纵轴上的截距为1/Vmax，在横轴上的截距为-1/Km。应用双倒数作图法可以求酶的Km值。 酶浓度对酶促反应速度的影响 当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此时反应速度与酶浓度成正比，本实验可以帮助检查酶促反应条件的准确性和可行性。 实验器材 试管、定量移液管、水浴锅、分光亮度计 实验试剂 PH为10的缓冲液、3、6、12mmol/L底物液、（1:4000）酶液、酚试剂、0.5mol/L碳酸钠 操作步骤及结果 底物浓度对酶促反应速度的影响 按下表操作 试剂（ml）\管号 1 2 3 4 5 6 pH10.0缓冲液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 3mmol/L底物液 0.1 6mmol/L底物液 0.1 12mmol/L底物液 0.1 0.3 0.5 蒸馏水 0.5 0.4 0.4 0.4 0.2 酶液（1:4000） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 底物浓度mmol/L 0 0．2 0.4 0.8 2.4 4.0 混匀后，370C保温15分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5mol/L碳酸钠 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀后，370C保温15分钟 混匀后，以1号试管为空白对照管，用660nm波长比色，测定各管吸亮度 底物浓度倒数L/mmol 5.00 2．50 1.25 0.42 0.25 A 0 0.304 0.386 0.487 0.549 0.610 1/A 0 3.29 2.59 2.05 1.82 1.64 以吸亮度倒数为纵坐标，底物浓度倒数L/mmol为横坐标作图，求米氏常数 实验所作图如下 酶浓度对酶促反应速度的影响 按下表操作 试剂（ml）\管号 1 2 3 4 5 pH10.0缓冲液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 12mmol/L底物液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 酶液（1:4000） 0.1 0.2 0.3 0.4 混匀后，370C保温10分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5mol/L碳酸钠 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀后，370C保温15分钟 混匀后，以1号试管为空白对照管，用660nm波长比色，测定各管吸亮度 酶浓度（1:4000）×15 0 1 2 3 4 A 0 0.139 0.198 0.237 0.305 以吸亮度为纵坐标，酶浓度（1:4000）×15为横坐标作图，观察反应速度和酶浓度的关系 【附注】 1号试管是空白管不加酶液（在酶浓度试验中，应同时做相同的不同酶浓度的对照管，以校正酶液本身可能存在天然酚含量，但在本实验中，所用酶液中天然酚含量较小，可略去不计） 实验所作图如下 结论及讨论 结论 根据所作图，又由于吸亮度A反映的是酶促反应的速率的快慢，即A与反应速度成正比，由此可推知1/V与1/[S]称线性关系。以1/A对1/[S]作图得到一条直线，其在横轴上的截距为-1/Km。应用双倒数作图法可以求酶的Km值。由图可求出Km=0.20 当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此时反应速度与酶浓度成正比。 讨论 由于坐标纸不够充裕而使作图不够精确，最终使作图所求Km值产生误差。 由于分光亮度计本身的误差而使实验所得数据有一定的误差。