6酶、细胞、原生质体固定化.pptVIP

; 第二章 酶与细胞的固定化 ;1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。 3.分离纯化困难。 ;一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点 1.固定化酶(immobilized enzyme) 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 ;什么是固定化酶？;优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。; 2. 固定化细胞（immobilized cell） 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。; 优越性： (1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。; 3.固定化原生质体 意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。; 二、固定化方法; 依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。 ; 根据吸附剂的特点分: 1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM- 纤维素;优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解吸附。 ; 借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。;;2）偶联方法： 偶联成功与否取决于： 载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。 酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。 ; 常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。; 优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。 缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。 ;3.交联法（crosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。 双功能试剂： 常用的是戊二醛 O O H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H ; 戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。 ; 交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。; 缺点： (1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。 ;4. 包埋法（entrapment）;1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法;海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至 海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法： 滴至 角叉菜胶＋E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC) 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED;2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。 半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。; 与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入