高效液相色谱法培训课件精编PPT课件.ppt

中等极性键合相——常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，应用较少。 极性键合相——可作正相或反相色谱使用 氨基键合相： 硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2] 氰基键合相： 硅胶-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN] 键合相色谱pH控制在2-8 ZORBAX SB-C18键合相 使用独特的键合方式，用特殊的二异丁基硅烷对硅氧烷键进行保护，防止了极端pH和高温条件下键合相的水解，这些大侧链阻止了键合相的流失，提高了重现性，延长了柱寿命。 新型固定相 注意：pH范围0.8-8.0，最高操作温度90℃， 缓冲液浓度0.01-0.02M，避免使用磷酸盐与碳酸盐 ZORBAX Extend-C18色谱柱——采用C-18二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。 在pH高达11.5的条件下，用于分离碱性、酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。 色谱柱使用注意点： pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液， 最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。 分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。 柱 pH范围 最高温度 SB C18 90℃ C8 60℃ C3 60℃ 苯基 60℃ 腈基 60℃ XDB 60℃ Extend-C18 60℃ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件 色谱柱使用与保存 所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱 色谱柱 柱体积 冲洗体积 150× 4.6mm 2.5ml 50ml 200× 4.6mm 3.3ml 65ml 250× 4.6mm 4.2ml 80ml 保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱两端必须用接头密封。 停用数天后最使用时，应先用低流速甲醇冲洗1h左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。 新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min）。 色谱柱失效症状 色谱柱压增高 峰变宽，拖尾，裂峰 塔板数下降，选择性下降，分离度降低 保留值减小或增大 色谱柱失效的原因 进口滤片堵塞 吸附了样品杂质 柱填充不良，使用久， 机械及热冲击造成空洞 固定相遭化学侵蚀 原因 压力 拖尾 塔板数 选择性 保留值 堵塞 # ## ## 空洞 ## ## 吸附样品 # 化学冲击 # # ## ## 柱凹陷——出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐平，可用相同填料填平凹陷处。 压力影响——应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动，会使色谱峰产生裂隙。 柱压升高原因 强保留样品组分——强吸附组分易聚集在柱进口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。 解决办法 使用保护柱可延长分析柱寿命。 每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。 并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱。 样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后