荧光分析法教学课件.ppt

荧光分析法 分子荧光产生机理： （1）定义： 物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时发射出波长与入射光相同或较长的光，称为荧光。一种物质分子能否发射出荧光取决于它本身的分子结构和它所在的环境条件。 （2）分类： 1．原子荧光分析法 2．分子荧光分析法 一．定义和分类 荧光，磷光，化学发光三者之间有何区别 化学发光只是众多发光类型的一种,发光还包括电致发光、生物发光等等,发光机理各不相同,但都是其它形式的能量转化为光能,化学发光是提供化学反应所产生的能量.荧光,磷光都隶属于光致发光.荧光是由第一激发单线态(两个电子自旋方向相反)至基态的辐射跃迁,而磷光是指电子从第一激发三线态(两个电子自旋方向相同)到基态释放的辐射跃迁,相对而言,荧光用得较多. 磷光的波长比荧光的波长长 通常所指的荧光是指紫外-可见光荧光，即利用某些物质受到紫外-可见光照射后，发射出比吸收的紫外-可见光波长更长或相等的紫外-可见光荧光。通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为分子荧光分析。 荧光分析可应用于物质的定性及定量，由于物质结构不同，所能吸收的紫外-可见光波长不同，所发射的荧光波长也不同，利用这个性质可鉴别物质。对于同一物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可以进行定量测定。 荧光，磷光，化学发光三者之间有何区别 缺点 :许多物质本身不会发射荧光、应用不够广泛 1.灵敏度高 ：检出限为10-4~10-6g/L 。较紫外-可见分光光度法高1~3个数量级。 2.选择性强 ：能吸收光的物质并不一定能产生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长的光，但产生的荧光波长也不尽相同 。 3.用样量少、操作简便 。 主要特点 荧光应用的优势 可以灵活地利用各种类型的荧光探针和荧光染料对目标物质进行特异性标记，大大减少杂质的信号干扰 可以进行活细胞或活体检测（细胞毒性小） 可以进行多重专一性标记（如蓝色细胞核/红色线粒体） 荧光应用的局限性 背景荧光干扰 微孔板的自发荧光 细胞的内源荧光 激发光谱和荧光光谱 任何荧光物质都具有两个特征光谱，即激发光谱和荧光光谱。 激发光谱:如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下荧光强度的变化，以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。 荧光光谱:固定激发光波长和强度，而让物质发出的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以荧光的波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便得荧光光谱。 荧光分光光度计结构示意图 透射光 吸收光谱 氙灯(或高压汞灯） （200-800 nm) 荧光分光光度计结构示意图 可获得的信息 分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等 分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭 分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等 分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新的荧光峰的产生 分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等 荧光定量方法 标准曲线法又称校准曲线法: 将贮备标准液稀释为所需要的标准系列，用零浓度调仪器零点后，依次由低到高浓度测量标准液的吸光度(或峰高、面积)，同时测定样品和样品空白的吸光度(或峰高、面积)，在坐标纸上以标准液浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。它一般适用于已知样品的基本成分和标准液的基本成分相接近的样品。 ?标准加入法: 分别在数份相同体积样品液中加入不等量的标准液，一定要有一份相同体积样品液中加入的标准液为零，按照上面绘制标准曲线的步骤测量吸光度(或峰高、面积)，在坐标纸上以加入的标准液浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，用外推法(延长标准曲线和横坐标相交的数的绝对值)就可得到样品液浓度。它一般适用于组份较复杂的未知样品，能消除一些基本成份对测定的干扰，但对测定的未知成分含量要粗略估计一下，加入的标准液要和样品液浓度接近。 选择合适的参比溶液 其它试剂均无荧光，用纯溶剂（水)作参比溶液； 若其它试剂略有荧光，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液； 荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的效率。 荧光量子产率定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。 ? 发射量子数 ? ? ????? 吸收量子数 ? 量子产率 (quantum yield) 荧光共振能量转移 fluorescence resonance energy transfer，FRET 两个荧光发色