实验十一-Southern杂交分析.pptxVIP

11.植物基因组DNA的Southern杂交;1、植物基因组DNA的提取与纯化 2、植物基因组DNA的酶切 3、酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southern blotting 4、探针序列的获得与标记 5、探针与基因组DNA的杂交 6、杂交信号的检测;一、Southern blotting（变性DNA转移到膜上）;脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤;标准柠檬酸盐缓冲液 （pH 7.0）;酶切基因组DNA的凝胶电泳;琼脂糖凝胶的处理;;Southern转膜过程;转移方法和膜注意事项： 1、凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题，EB也可以加入到样品中。 2、所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验。 3、根据我们的经验，用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。 4、碱性转移（如在0.4M NaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker的转移。;如果你想采用;如果;;此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原（steroid hapten）去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。;操作程序;DIG-High Prime labeled probes can be used in northern, Southern-, and dot-blot analysis, as well as colony and plaque hybridizations. This kit offers random-primed labeling of DNA templates with DIG-11-dUTP, alkali-labile, and chemiluminescent detection of the DIG-labeled hybrids. This kit was assembled with convenience in mind, offering ready-to-use CSPD supplied with a dripping device for easy application, ready-made blocking solution, and DIG Easy Hyb granules. The DIG-High Prime mixture includes stabilized Klenow enzyme, nucleotides, primers, and reaction buffer, all in one convenient reagent. ;DIG-High Prime, 5x conc., 50 μl （用于探针标记） DIG-labeled Control DNA, 20 μl, (5 μg/ml) pBR328 (linearized with Bam HI) （用于估测探针产量） DNA Dilution Buffer, 3 x 1 ml （用于估测探针产量） Anti-digoxigenin-AP Conjugate, 50 μl （化学发光检测探针-靶序列杂交） CSPD, ready-to-use, 50 ml （化学发光检测探针-靶序列杂交） Blocking Solution, 10x conc., 4 x 100 ml （化学发光检测探针-靶序列杂交） DIG Easy Hyb Granules, 4 x 100 ml （用于探针与膜的杂交）;步骤;杂交工作溶液的制备 分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。 杂交温度 适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。;步骤;3、洗膜;溶液;试剂盒工作溶液的制备;免疫检测步骤：完成一张100cm2膜的免疫检测方法;1、显影液：D-76显影液 2、停影液：（2%冰醋酸溶液：980ml 水+20ml 冰醋酸） 3、定影液：F