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1.1.1 Gibson assembly
简介( INTRODUCTION )
原理: Gibson assembly 是一种 one step, one pot 的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需
要的三种酶混合在同一个管内在 50°C 下培养 15-60 min 就可以得到组装好的 DNA 。
装配原理基于 DNA 片段间的重叠区域, 过程依赖于三种酶: DNA 外切酶 (T5 exonuclease ), 高
保真 DNA 聚合酶。 (Phusion polymerase )和耐热 DNA 连接酶 (Taq DNA ligase )的共同作用。
首先, T5 核酸外切酶消化 DNA 片段的链 方向是从 5’到 3’.每个 DNA 片段分别形成一个单链
的突出部分, 由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补, 所以 DNA 片段退火,
互补的序列重新配对连接。 然后,在空缺的部分 DNA 聚合酶以另一条 DNA 单链为模板, 沿 3 方
向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上,填补缺口。最后,连接酶将两条 DNA 单链黏合起来,密
封裂缝。这样具有重叠区域的 DNA 片段就组装成一整条 DNA 分子了。下面是组装的示意图。
材料( MATERIALS )
试剂( REAGENTS )
NAD ,H O ,1 M MgCl ,1 M DTT ,10 mM dNTP mix ,1 M Tris-HCl pH 7.5 ,50% PEG-8000 ,
2 2
2.7 mg/ mL Tag ligase ,0.85 μg/ mL T5_ExO,Phusion(1 )×、LB 培养基、 抗生素 (据载体而定)、
LB 平板(相应抗性)
实验前准备( SETUP )
于冰水浴中配制如下反应体系。 如果不慎将液体粘在管壁, 可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly buffer
NAD 20 mg
H O 300 μL
2
1 M MgCl 2 300 μL
1 M DTT 300 μL
10 mM dNTP mix 600 μL
1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL
50% PEG-8000 3 mL
加水到 7.5 mL ,每管分 500 μL存于 -20 °C 或 -80 °C 冰箱 ,够 3000 个反应
2 × assembly mix: best combination:
100 reaction 1 mL
2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL
0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μL
Phusion(1 )× 25 μL
4 × G.A. buffer
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