基因型鉴定protocol.docVIP

一、基因型鉴定protocol 1、剪尾取样及编号 从鼠房取出需要基因型鉴定的小鼠（由于小鼠一般在21天时已经断奶，故小鼠剪尾的时间应不小于三周），查看鼠箱上的基因信息，根据基因信息从编号笔记本上找出相应编号，续编。 ①在EP管上预先写明小鼠编号 ②从鼠箱中取出老鼠（戴上手套后用手抓住小鼠尾部向上提出，提住鼠尾不放，将小鼠慢慢放至实验台上，此时小鼠会向前爬动，用另一只手从背侧捏住小鼠背部皮肤，要注意捏的位置尽量靠近颈的上部，防止小鼠的头部扭动），从小鼠尾端用剪刀剪下3mm左右鼠尾（不可超过5mm,会使小鼠受伤），将剪下的样品放入对应编号的EP管内，用电烙铁烫及小鼠尾部剪口处，一定要使伤口烫合，防止其流血不止。然后对小鼠进行鼠耳编号。（注意：编号时要记录小鼠的性别） 2、DNA提取 ①向每只含样品的EP管内加入400微升消化液（含蛋白酶K），将其置于混合仪上消化，55℃（此温度下DNA在水中的溶解度最高，即最为稳定），3h。 ②向消化后的样品中加入400微升异丙醇，反复颠倒，一般可见絮状分层（个别样品看不到）。之后放至离心机13000r，10min。 ③去上清，加入750微升70%乙醇，13000r，10min。重复此操作一次。 ④去上清，将EP管倒置于吸水纸上或置于空气中晾干。(最好晾干，倒置在吸水纸上有可能会使一部分DNA流失) 3、PCR(例，三转小鼠，做三次PCR，每次PCR针对的基因不同，所用引物不同，每次PCR做样品数+3（空对照：不加模板；正对照：突变型小鼠的样品；负对照：野生型小鼠的样品）个体系)。单个体系如下： ddW 18 10*buffer （含Mg2+） 2.5 dNTP(2.5mM) 2.5 Primer R(20μM) 0.25 Primer F(20μM) 0.25 Taq酶 0.5 Template 1 程序： 94℃ 预热 ~ 4min 94℃ 变性 ~ 1min 61℃ 退火 ~ 1min 30个循环 72℃ 延伸 ~ 1min 72℃ ~ 7min 4℃ ~ hold 注意盖子盖紧。 4、琼脂糖电泳 ①配胶，根据规格来配，如80ml规格，称量0.8000g琼脂糖，加入80ml 0.5*TBE buffer。加热至沸腾（80ml~90s;40ml~90s;20ml~30s）,待冷却至60℃时加0.001%的EB.倒至插有梳子的胶板上，待用。 ②上样 6*loading buffer ~ 5μl 样品或对照 ~ 25μl ③电泳，140V ④凝胶成像分析系统，将结果填入信息卡，并在卡上注明日期。