westernblot总结前人的经验.pptVIP

SDS－PAGE 电泳详细过程 （1） 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干 （2） 灌胶与上样 1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要 使两玻璃对齐，以免漏胶。） 2、 根据蛋白大小配制一定浓度的分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用 1ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。 然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才 不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 异丁醇：8% 4、 按前面方法配 5％的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空 间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以 免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收 缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经 常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻 轻将其拔出。 5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向 外。） 6、 测完蛋白含量后，计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样 品至 PCR管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（5×SDS 上样缓冲液事先跟巯基乙醇按1ml加50ul配好。）上样前要将样 品于沸水中煮 5min 使蛋白变性 灌制积层胶 插入梳子 7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。） 用微量移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液枪的枪头插 至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也 可能使样品溢出），没加一个样品要换一次枪头 （3） 电泳 电泳时间一般 1.5h，电压为 浓缩胶80V 较好，分离胶120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止 电泳，进行转膜。 Staking gel Separating gel 转膜 （1） 转一张膜需准备 6 张 5x9cm的滤纸和 1 张 4x8cm的PVDF膜。切 滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的膜 置于甲醇中浸 15秒才可使用。 （2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。 （3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。 （4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作 在转移液中进行，要不断的擀去气泡。 * * 2. 电泳(Electrophoresis)  2.1 SDS凝胶配制 配制相应浓度的SDS分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。 ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。 覆盖层可保持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 * 配制相应体积的积层胶液体，在已聚合分离胶上直接灌注积层胶液体，立即插入加样