细胞体外培养的基本方法和过程.PPTVIP

细胞内的冰晶损伤（intracellular ice-damage）： 是指因细胞内部结冰而致的细胞损伤。 纯水 （细胞悬浮其中） 低于零度 结冰 细胞内外的水分都会结冰 冰晶造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 溶质损伤（solute damage）或称溶液损伤（solution damage） 是指因保存细胞的溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤。 溶液 （细胞悬浮其中） 温度下降 细胞外的水分先结冰 在复温时，大量水分就会渗入细胞内，造成细胞死亡 未结冰的溶液中电解质浓度升高 细胞在高溶质的溶液中时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便会发生渗漏。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 在溶液中加入冷冻保护剂(cryoprotectant)时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。 因为冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度，降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。 在复苏时，一般以很快的速度升温，1～2 min内恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而不会产生冰晶损伤和溶质损伤，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。 冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 （１）冷冻速率 细胞在冷冻过程中会发生如下生理变化： * 当细胞被冷至-5℃左右时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低了溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰； * 当细胞被冷至-5℃～-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能，其结果是：细胞内水分为了和细胞外水分保持化学能的平衡，会向细胞外流动。 是指降温的速度。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况就会不同： （1）冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰； （2）冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰； （3）冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 （１）冷冻速率 超快速玻璃化冷冻：是细胞存活最理想的冷冻方法。 因为细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中暴露时间过长而受损。 不同细胞的最适冷冻速率不同。所以，在对一种细胞进行冷冻保存之前，首先要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高冷冻存活率。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 （１）冷冻速率 （２）冷冻保存温度 是指能长久保存细胞的超低温度。 在超低温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，经过长期保存在复苏后仍能保持正常的结构和功能。 液氮温度（-196℃）是目前最佳冷冻保存温度。 在-196℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能保持完好。 如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃均可保存十年以上。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 （３）复温速率 是指在细胞复苏时温度升高的速度。 复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说复温速度越快越好。 复温速度过慢，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。 最佳的复温速率与最佳的冷冻速率对保证获得最佳的冻存效果同等重要。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 （４）冷冻保护剂 是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。 冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类 ： 渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内， 一般是一些小分子的物质。 主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酞胺、 甲醇等。 非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内， 一般是些大分子物质。 主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、蔗糖、 聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及 羟乙基淀粉等。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 渗透性冷冻保护剂保护细胞的机制是： （1）在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤； （2）细胞