形态学研究及其方法进展讲义.ppt

3.3 间接法原位PCR 特点：PCR体系中dNTP和引物均不标记 PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交 标记物：以生物素、地高辛较为常用 操作程序： 组织细胞制备：固定、预处理 渗入和原位扩增：dNTP，引物, Taq DNA聚合酶 扩增产物检测：ICC 原位杂交： 用特异性标记探针 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 评价：目前最常用 优点：扩增效率高 特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 举例：石蜡切片，Dig标记 标本制备：10%福马林固定，石 蜡切片5 ?m。 预处理： ①脱蜡至水; ②0.2mol/L HCl，10’; ③5 ?g/ml 蛋白酶K 37℃ 10’; ④RNase消化37℃ 30’; ⑤Alc脱水干燥。 原位扩增： ①PCR扩增反应液30 ?l，加盖片封边; ②PCR热循环：94℃ 1’，55 ℃ 1’， 72℃ 1.5’， 25-30个循环， 72℃延伸 10’； ③去盖片，4%多聚甲醛后固定10’； ④ Alc脱水干燥。 原位杂交： ①Dig标记探针，98 ℃变性10’，-20 ℃退火5’，42 ℃杂交过夜； ②洗涤：2×SSC 10’ ×3，1×SSC 10’ ×3，缓冲液洗10’ ×3； ③AKP-Dig-Ab，37 ℃，2h; ④BCIP/NBT显色； ⑤脱水、透明、封固。 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.4 原位RT-PCR 原理： 逆转录酶 mRNA为模板 cDNA Taq聚合酶 cDNA为模板 扩增产物 直接（直接法）或原位杂交（间接法）检测扩增产物 注意： 标本先以DNase处理过夜，破坏DNA 反转录条件42℃,30’-60’ 反转录后加热90℃以上灭活逆转录酶 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 程序： 组织细胞制备：10%福马林固定。 预处理：DNase消化过夜；蛋白酶K消化（54℃,20’）；95℃,3’灭活蛋白酶K。 逆转录反应：反应液含逆转录酶、引物、dNTPs，并有RNase抑制剂,42℃,30’-60’。 95℃10’灭活逆转录酶。 PCR扩增：加Taq聚合酶、引物、dNTPs扩增；扩增后烤80℃, 15’-30’。 原位杂交：原位杂交后或直接用ICC检测扩增产物。 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.5 原位再生式序列复制反应(原位3SR反应) 原理：直接进行RNA扩增，检测细胞内低拷贝mRNA 特点：3种工具酶：AMV逆转录酶、RNase H、T7RNA聚合酶 引物5’端有T7RNA聚合酶启动子 扩增反应42℃，2h，不需热循环 程序：细胞固定、脱水干燥； 制备5’端含T7启动子的引物； PCR制备标记探针（Dig-11-dUTP）； 原位扩增（反应液含引物、dNTPs、3种酶等）； 原位杂交（加探针95℃变性10’， 40℃杂交过夜，显色 ） 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.6 原位PCR的对照试验 已知阳性、阴性对照试验 省去或用无关引物替代特异性引物 标本用DNase或RNase预处理 直接、间接原位PCR中省去DNA聚合酶 原位RT-PCR和原位3SR反应中省去逆转录酶 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.7 原位PCR的应用 检测内源性基因 固有基因定位--最敏感，低拷贝 异常及变异基因--与遗传性疾病的研究 检测外源性基因 感染（病毒、细菌）基因--诊断 转基因，基因治疗--基因定位、有无突变 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.8 原位PCR存在问题及对策 敏感性：在细胞制备高(单拷贝)；在切片标本低，扩增效率低 特异性：间接法高，直接法低（假阳性） 原位扩增时采用热启动PCR或套式PCR可提高特异性 引物延伸时掺入Bio-dNTPs→合成的新链体积大→不 易扩散 用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增→多个不 同长度扩增产物重叠交织→不易扩散，且敏感性提高 复杂性：需规范操作，需对照试验