二叶绿体的分离与观察.PPTVIP

* 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 * 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 * 游离叶绿体与叶片中的最大区别就是缺少了叶片细胞的环境，荧光效应是叶绿素分子受光激发至第一三线态返回基态时产生的。如果是在叶片中叶绿素分子会把吸收来的光量子传至光系统，所以在同等光强的情况下激发叶绿素分子的光量子就少了，所以荧光效应较弱。 在叶片或叶绿体中发射荧光很弱，肉眼难以观测出来，耗能很少，一般不超过吸收能量的5％，因为大部分能量用于光合作用。色素溶液则不同，由于溶液中缺少能量受体或电子受体，在照光色素会发射很强的荧光 实验二 叶绿体的分离与观察 【实验目的】 通过植物细胞叶绿体的分离，掌握细胞器分离的一般原理和方法。 【实验原理】 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 细胞组分的离心分离 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol／L氯化钠或 0.4mol／L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在 2 000 r／min的条件下离心 2 min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在 3 500 r／min的条件下离心 5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程在0～5℃的条件下进行。 G=1.119×10-5×R×(RPM)2 G：离心力，用g或× g表示 R：离心机转子的半径 RPM：离心机转数 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。 有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 【实验用品】 一、仪器用具 普通显微镜（配目镜测微尺，物镜测微尺），荧光显微镜，冷冻离心机，组织捣碎机，电子天平，冰箱，超声波清洗机，离心管，烧杯，量筒，滴管，纱布，刀片，镊子，载玻片，盖玻片，无荧光载玻片，无荧光盖玻片，吸水纸，擦镜纸，刀片，细口瓶，广口瓶，洗瓶，容量瓶。 二、材料 新鲜蔬菜。 三、试剂 0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙，95%酒精。 【方法与步骤】 一、叶绿体的分离与观察 1．选取新鲜的嫩蔬菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于预冷研钵中，加预冷的0.35 mol/L氯化钠溶液研磨至匀浆（10~15ml） 。 2．将匀浆用 6层纱布过滤于烧杯中。 3．取滤液 4ml在 2 000 r／min下离心2 min，弃去沉淀。 4．将上清液在 3 500 r／min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 5．将沉淀用 0.35 mol/L氯化钠溶液悬浮（1~2ml） 。 6．取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。 ②在荧光显微镜下观察。 ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。 7．观察叶绿体形态结构，测量5~10个的长轴和短轴。 二、蔬菜叶手切片观察 用锋利刀片将新鲜的嫩蔬菜叶切削一斜面置于载片上，滴加 1～2滴0.35 mol/L氯化钠溶液，加盖片后轻压，或切一薄片，置显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。 ②在荧光显微镜下观察。 ③用同样方法制片，但滴加 1～2滴0.01