诱导分化成熟脂肪细胞方案.pdf

Sigma 的试剂： IBMX （Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco 血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清 (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基 DMEM; （GibcoBRL-Cat# 11965-084 ） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次 3T3-L1 细胞共一 25cm3 培养瓶消化后传代分为 2 个 10cm 培养皿， 3 天后每个 10cm 皿分别传代 3 个 10cm 皿。共 6 个 10cm 皿，将其中 5 个皿细胞冻存于 -80 °，将一 个 10cm 皿中 3t3-l1 细胞分别接种于一个 6 孔板一个 12 孔板其中 4 孔和 2 个 10cm 皿， 待 2 个 10cm 皿中细胞铺满 90% 后消化冻存于 -80 。 二： 6 孔板和 12 孔板 4 孔即将用于分化。两者均在细胞铺满 90% 左右接触抑制 2d 开始加 诱导剂， 诱导方案严格按照之前计划的施行， 诱导剂①培养 2d 后换为诱导剂②培养 2d ，后 换诱导剂③培养，以后每 48h 换液，均采用诱导剂③， 8 天左右即可看到脂滴，此次整个诱 导过程共用 14 天，出脂滴后继续 48h 换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三： 3t3-l1 诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情 况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证 明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3- 异丁基 -1- 甲基黄嘌呤溶液（ IBMX ）配制。分子量 222 ，几乎不溶于水，现配现用， 0.22um 过滤除菌。 100 ×母液 （50mmol/L ）：11.5mg IBMX+940ul 超纯水 +60ul 1mol/L KOH 。 每毫升培养基加 10ul IBMX. 2 、胰岛素溶液配制。 比较难溶，-20 ℃保存 1 个月，使用 PH 2~3 的稀盐酸溶液助溶， 0.22um 过滤除菌。 100 ×母液 （1mg/ml ）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL 。每毫升培养基加 10ul 胰岛素。 3 、地塞米松溶液配制。分子量 516.41 ，0.22um 过滤除菌， -20 ℃保存 1 个月。使用无水乙 醇溶解， 1000 ×母液（ 1mmol/L ）。 1mg 溶于 25ml 无水乙醇，每 1ml 加 10ul 。 二、 3T3-LI 细胞系的培养、诱导 1、按常规贴壁细胞培养法培养于含 l0% NCS DMEM 高糖培养基中， 37 ℃、体积分数为 5 ％ CO2 、饱和湿度条件下培养， 2d 换液一次。 2 、3T3-Ll 细胞系的诱导：细胞生长状态良好时实验。细胞传代分瓶，每一瓶中的细胞数约 为 1 × 105 ，每 48h 换液。当细胞接触抑制 2d 后，加入诱导剂 (10% 胎牛血清 FBS 的高糖 DMEM 培养液（含 10ug/ml 胰岛素， 1umol/L 地塞米松， 0.5mmol/L IBMX ），培养 2d 。然 后换为 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养液（含 10ug/ml 的胰岛 素），培养 2d 。改为 10% 的胎牛血清的 DMEM 培养液，每 2d 换液一直到诱导成为成熟的 脂肪细胞 (细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴