实验动物胚胎工程.ppt

* * 2.2、精子的制备及获能 2.2.1.精子的获取 精子来源比较方便，大、中型实验动物，一般通过人工按摩采精或假阴道采精，都能获得成熟的精子，小型实验动物都是通过手术，从驻精囊和输精管内取得成熟的精子。 2.2.2 精子的分离与制备是体外受精技术中的一个关键环节 精液中的精子获能抑制因子 冷冻精液中的防冻剂和蛋黄等成分 影响和干扰受精的完成 过多的留在受精液中的死精子 ① 悬浮法（swim up）： 是筛选高活力精子最为有效的一种方法。 ② 玻璃棉（glasswool）过滤法：该法可有效地滤除品质较差精液中的死精子，大提高精子的受精穿透率。 方法： 2.2.3精子的获能：刚射出的精子不能穿入卵子，只有在雌性生殖道内度过一段时间之后，才获得受精能力的现象。 ③ BAS/哌可（Percoll）密度梯度离心法： 采用不连续的BSA密度梯度可以分离得到形态正常的高活力精子。 ④ 离心洗涤法：对于精子活力较好的精液可采用直接离心洗涤法制备用于体外受精的精子。 2.2.4 精子获能原理 雌性动物生殖道内的获能因子中和 精子表面的去能因子 精子质膜的胆固醇外流 Ca2+进入精子内部 膜的通透性增加 获能完成 膜蛋白重新分布，膜的稳定性 下降 cAMP(腺苷-3,5-环化一磷酸 )浓度升高 激活腺苷酸环化酶 抑制磷酸二酯酶 目前精子的获能处理方法主要有： ① 与血清白蛋白的溶液长时间孵育： 原理是血清中白蛋白具有很强结合胆固醇和锌离子的能力，可除去质膜中部分胆固醇和锌离子，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。 ② 用高离子强度溶液处理精子： 精子表面的去能因子（被膜蛋白），当用高离子强度溶液处理精子时，将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 ③ 与含有卵泡液的培养液进行孵育： 在培养液中添加一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子获能。 ④ 使用钙离子载体A23187： 直接诱发Ca2+进入精子细胞内部，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致精子获能。 ⑤ 使用肝素： 是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种接近于体内获能的生理性方法，已经成为动物体外受精应用最广的一种精子获能方法。 三、体外受精 1.方法和体外培养系统：体外受精的完成需要一个有利于精子和卵子存活的培养系统。目前，主要包括微滴法和四孔培养板法。 ①微滴法： 是在塑料培养皿中用受精液做成20－40μl的微滴，上覆石蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵母细胞10－20枚及获能处理的精子（1.0－1.5）×106个/ml，在培养箱中孵育6－24h。 ②四孔培养板法： 每孔加入500μl受精液和100－150枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子（1.0－1.5）×106个/ml，而后在培养箱中孵育6－24h。 精子入卵的三道屏障： 扩展的卵丘 透明带 卵质膜 弱精、畸精、少精症患者的精子很难穿越三道屏障 人为使得精子获能 可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。 （3）.受精 获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下在 或 中完成受精过程。 获能溶液 专用受精溶液 （4）、胚胎的早期培养 概念：是应用人工创造条件，对获取的 进行体外培养。 培养液成分：水、无机盐、糖类、维生素、氨基酸、激素、核苷酸、血清等 早期胚胎 不同动物胚胎移植时间不同 牛、羊：桑椹胚或囊胚阶段 小鼠、家兔：卵裂期或囊胚阶段 试管婴儿：8个或16个细胞阶段 胚胎培养发育到适宜阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。 四、体外受精技术的发展现状和存在的问题 （一）发展现状 牛的IVF水平最高，卵裂率为80％～90％； 受精后第七天的囊胚发育率为40％～50％； 囊胚超低温冷冻后继续发育率为80％，移植后的产犊为30％～40％。 平均每个卵巢可获得A级卵母细胞10个左右，经体外受精可获得3～4个囊胚，移植后产犊1～2头。 * * （二）存在的问题和发展方向