单克隆抗体技术及其应用.ppt

单克隆抗体技术简介 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 单克隆抗体（monoclonal antibody）：针对预定抗原的同一抗原决定簇的，高度同质的，且能保证无限量供应的抗体。 单克隆抗体技术的理论依据：抗体的多样性、克隆选择学说、抗体基因的重排理论、抗体结构与生物合成机制。 实验原理 杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是： 骨髓瘤细胞：可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。 脾细胞（B淋巴细胞）：它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长。 在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的骨髓瘤细胞与经免疫的脾细胞进行融合。杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培养基（HAT）中生长进行选择。 在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。 用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 杂交瘤技术的操作流程 杂交瘤技术的操作流程 杂交瘤技术的操作流程 杂交瘤技术的操作流程 杂交瘤技术的操作流程 单克隆抗体制备原理 单克隆抗体制备过程的注意事项 严格进行无菌操作，防止污染（细菌、霉菌、支原体、细胞） 根据实验的目标及时进行细胞的检测与筛选，（ELISA、IFA、凝集、中和，……） 对筛选得到的阳性细胞克隆进行早期单克隆（有限稀释法） 在单克隆细胞建株过程中不定期验证检测 防止单克隆细胞过度生长 ——老化 死亡 单克隆抗体与免疫血清的比较 单抗 单克隆抗体技术的应用 Fish Disease Research Center Fish Disease Research Center 单克隆抗体技术 杂交瘤技术 通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。 细胞融合技术： 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 长命 不分泌抗体 分泌抗体 短命 分泌抗体 长命 杂交瘤细胞筛选的原理 ： HAT培养基筛选 一. 动物免疫 二、细胞融合及HAT筛选 三、抗体的检测 四、杂交瘤细胞的克隆化 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 特定目标抗原 动物 免疫 脾脏中B淋巴细胞 B淋巴细胞大量增殖 刺激 能分泌针对于该抗原的特异性抗体 一. 动物免疫 二、细胞融合及HAT筛选 三、抗体的检测 四、杂交瘤细胞的克隆化 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 细胞融合方法 1.病毒介导的细胞融合 2.聚乙二醇（PEG）介导细胞融合 3.电激融合 融合效果更好，且避免了病毒的污染问题， 一. 动物免疫 二、细胞融合及HAT筛选 三、抗体的检测 四、杂交瘤细胞的克隆化 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 要求： 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品 1.酶联免疫吸附法 2.间接免疫荧光法 3.放射免疫法 4.双相扩散法 常用方法： 酶联免疫吸附法(ELISA) 技术原理： 抗原 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 一. 动物免疫 二、细胞融合及HAT筛选 三、抗体的检测 四、杂交瘤细胞的克隆化 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 常用克隆化方法 有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells) ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。 一. 动物免疫 二、细胞融合及HAT筛选 三、抗体的检测 四、杂交瘤细胞的克隆化 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 常用的大规模培养方法： 动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交