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罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书 注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。 试剂盒组成： 小瓶/盖子 标签 内容物 1 蓝色 酶溶液 大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶，在storage buffer中 10×conc. 5×50ul 2 紫色 标记溶液 在reaction buffer中的核苷酸混合物 1×conc. 5×550ul 3 黄色 转化-POD 抗荧光素抗体，绵羊Fab片段，连接有辣根过氧化物酶 Ready-to-use 3.5ml 需要自己配置的其他物品： 除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览： 步骤 设备 试剂 样品准备section 3.2 黏附细胞，细胞涂片和细胞离心涂片准备 section3.2.1 冰冻组织section3.2.2.2 Washing buffer：磷酸缓冲液PBS* Bloking buffer封闭缓冲液：溶于甲醇的3%H2O2 Fixation solution固定剂：溶于PBS的4%多聚甲醛，ph7.4，新鲜配制 Permeabilisation solution渗透溶液：溶于0.1%柠檬酸钠的0.1%Triton X-100，新鲜配制（6） 固定剂 石蜡包埋组织 section3.2.2.1 二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中） Washing buffer：PBS* 蛋白酶K*，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于10mM Tris/HCL中，ph7.4-8] 替代处理方案 ※渗透溶液：（0.1%Triton1） X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制 ※胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶*，0.01N HCL，不含核酸酶 ※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射 标记步骤 section3.3 阳性对照 section3.3.1 微球菌核酸酶或 DNase I，重组，级别1* 黏附细胞，细胞涂片和细胞离心涂片和组织 section3.3.2 Parafilm石蜡封口膜或盖片 湿盒 Washing buffer：PBS* Difficult tissue 困难组织 塑料容器 微波 湿盒 Citrate buffer柠檬酸盐缓冲液，0.1M，ph6.0 Washing buffer：PBS* Tris-HCL，0.1M ph7.5，含3%的BSA*和20%正常牛血清 信号转换 section3.4 湿盒 Parafilm石蜡封口膜或盖片 Washing buffer：PBS* DAB Metal Enhanced Substrate Set*DAB金属增强底物*或POD底物替代物 光镜镜检封固剂 产品概述： 特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂 实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。两种情况均能产生假阴性。 假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段 DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查 凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数 样本：细胞离心涂片和细胞涂片 在chamber slides上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透 检测次数：一个试剂盒50T 试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可 试剂 储存和稳定性 TUNEL反应混合物 TUNEL反应混合物应在用前临时配制，不能储存 TUNEL反应混合物用前应置于冰上 转化-POD 一旦融化转化-POD溶液后，应储存于2-8 注意：禁止冰冻结冰 优点： 优点 特点 灵敏 在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断 特异 对坏死来说，优先标记凋亡 快速 分析时间短（2-3h） 简便 试剂稳定、优化，没有稀释步骤 灵活 适合于固定细胞核组织，允许堆积、贮存和转运样本 双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段 Function-tested功能检查 对于大量的批号来说，每一批号均进行了功能检测 步骤和所需材料： 1 流程图： 2 样品准备 2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片 需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲