生物技术综合实验原生质体相关.docVIP

PAGE / NUMPAGES 生物技术综合实验报告 （第一部分） 实验一 工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌 实验目的 掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。 原理 培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。 湿热条件(121℃的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。 器具和试剂 灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。 琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮 。 四、 实验内容 PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备 （一）培养基的配制步骤 1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。 2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。 3、用NaOH或者 稀HCL调剂酸碱值。 4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。 5、高压灭菌（121℃,15min-20min)。 6、冷却，取出，备用。 （二）棉花无菌苗培养基的制备 1、取25 ml MS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为6.0，加入7.5g/l 琼脂煮沸。 2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。 3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。 4、灭菌后置于水平的工作台上冷却即可。 要求：配制 1L （三）拟南芥无菌苗培养基的制备 1、拟南芥无菌苗培养基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g琼脂高温高压灭菌。 2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121°高压灭菌15分钟。 3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。 要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。 五、注意事项 1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。 2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。 3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。 4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。 5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。 实验二 无菌苗的制备 原理 化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。 物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。 实验材料、器具和试剂 棉花品种YZ1;拟南芥col-0野生型 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。 0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精 实验内容 （一）拟南芥无菌苗培养基倒皿 1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。 2. 将上次灭菌好的9cm培养皿分开放置超净工作台（超净工作台需先打开）上。 3. 将融化好的培养基分装于培养皿中（500ml/18-20皿），将皿至于超净台上吹干.。 （二）共培养培养基的配制 成分 数量 成分 数量 MS大量元素 (20倍） 50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml) 1 ml NH4NO3 (20倍) 50 ml 甘氨酸 (1000倍) 1 ml 微量元素 (100倍) 10 ml KT (0.1mg/ml) 1 ml 铁盐 (100倍) 10 ml 葡萄糖 30g/L 微生素 (1000倍) 1 ml PH值 5.85-5.90 肌醇 (100倍) 1 ml 依次加入上述物质，调PH值5.85-5.90，然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。 （三