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小鼠转基因技术 基因打靶的简易程序 胚胎干细胞（ES细胞）法 优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 逆转录病毒感染法 主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。 优点 由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高度整合特性, 大大提高基因转移的效率 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体 缺点 获得纯合体的转基因动物的机会少 病毒载体构建复杂 转入的外源基因的大小受到限制, 10kb 转入病毒自身基因的复制表达 体细胞核移植法 首先将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕小鼠中 1997 年, 英国Roslin 研究所的Wilmut等利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体,成功获得了体细胞克隆绵羊多莉(Dolly) ,拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。 优点 减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。 事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力,具有很大的优越性。 缺点 体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基础理论和实验技术上还需进一步探索。 精子载体法 将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植,这样产生的动物也会使外源基因得到表达。 精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法 优点 基因转化方法简便,效率高 动物育种不经过嵌合体,实验周期短 缺点 目的基因整合的随机性 无法早期验证修饰事件 成功率不高、效果不稳定 YAC法（人工酵母染色体法） 优点： 克隆百万碱基对(Mbp) 级的大片段外源DNA 的能力,可以保证巨大基因的完整性; 保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变; 保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高; 鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效率。 缺点： 不稳定，制备工艺繁琐。 BAC法（人工细菌染色体法） 建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可300kb。 F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。100kb,近百个蛋白质。 可构建BAC文库； 有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre 重组酶； BAC载体两端有Sp6和T7 引物序列利于测序，确定基因的 染色体定位； 可稳定遗传，易于操作。 BAC文库：基因组酶切后100～300kbDNA+BAC?大肠杆菌 转基因小鼠技术的应用 基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究 基因工程定向育种 转基因动物生物反应器研制 人类疾病小鼠模型与基因治疗 药理学研究 器官移植 环境科学研究