Calcein-AM和PI鉴别死活细胞.docVIP

PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色 钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein?-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein?-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein?-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490?nm，发射：515?nm）。因此Calcein?-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535?nm，发射：617?nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490?nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545?nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein?-AM的合适浓度。???I．试剂??Calcein-AM???PI??? II．用荧光显微镜观察细胞形态?? ?以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。??１．染色溶液的配制?? 1）用1?ml无水DMSO溶解1?mg?Calcein-AM，制备成1?mmol/l?的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。?? 2）用1?ml?ddH2O溶解1?mg?PI，制备成1.5?mmol/l的PI储备液（1?mg?PI/1?ml?H2O），-20℃下密闭冷冻保存。?? 3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。?? 4）加10?μl?Calcein-AM储备液和15μl??PI储备液至5?ml?PBS中配制成染色溶液。????Calcein-AM的终浓度为2?μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。??? 2．细胞染色?? 1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。?????? 2）将细胞悬液离心3分钟(1,000?rpm)。?? 3）去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105?–106?个／ml。再用移液器充分混匀。?? 4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。?? 5）将200?μl细胞悬液移至小试管中，加入100?μl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。?? 6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。?? 7）在荧光显微镜下，先使用490±10?nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545?nm波长激发，能够看到红色的死细胞。??*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。?? *Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。??? 3．染色试剂的最佳浓度?? Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。?? 1）通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。?? 2）用0.1-10?μM?的PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。?? 3）用0.1-10?μM?的Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein?-AM浓度。接着用该浓度的Calcein?-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。???