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CFSE增殖实验-江英骙 PBMC增殖染色分2天 第一天 分PBMC，培养基为R10+双抗（100: 1），将细胞从15ml离心管转移至培养瓶中（大概5ml的培养基，不要超过培养瓶的线），37度孵箱培养1天，使单核细胞贴壁； CD3包被96孔平底板（eBioscience, functional的抗体，浓度为1mg/ml的CD3），PBS每1ml中加5ul的CD3，然后每孔铺100ul，用封口膜封板，避免污染，可用包装纸再包起来，4度冰箱过夜。 第二天 收PBMC，将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml离心管中（贴壁细胞不要）。先计数，离心，1800rpm，10min，弃上清，用预热的PBS（37度水浴锅提前预热无菌PBS）洗一遍细胞，离心，1800rpm，10min，弃上清，将细胞打散（用手弹）； CFSE应用预热至37度的PBS 调整至工作浓度（1ul的CFSE ，用预热的PBS加至终体积为2ml），每10的7次细胞加1ml；（15ml离心管） 细胞管中加入37度的CFSE 1ml ，混匀，并将试管壁反复吹洗（避免粘于试管壁的细胞未染色或染色量少造成染色不均匀）； 37度水浴锅避光孵育15min，中间至少震荡一次（用手弹）； 直接离心，1800rpm，10min； 加入R10+双抗（加入量是之前加入CFSE体积的5倍以上），5到10ml重悬，37度孵箱孵育5min； 离心，1800rpm，10min； 再洗一遍，重复步骤7 R10+双抗重悬，计数； 调整细胞浓度至1*10^6/ml，每孔加入细胞100ul 每孔加入新鲜配制的培养基100ul（R10+双抗，1ml加入CD28 5ul），每孔的终体积为200ul；（此时的培养基不用37度预热） 放入大细胞房培养7天，收细胞； 可染CD3，CD4(注意做blank对照)，进行流式分析（CFSE为FL1通道，与FITC为一个通道）。 新的CFSE的配制：50ug CFSE溶解于18ul DMSO即是5mM/L stock solution，分装为每管2ul，5mM/L，每次用时将2ul用预热的PBS 200ul稀释然后吸出100ul（就相当于吸出了1ul的CFSE ），然后补PBS 至2ml（就满足工作浓度1ul CFSE 加到2mlPBS中，2.5mM ），每1×10 ^7个细胞数或少与此就加1ml，多与此再换算。 5mM/L储存液2ul+1mlPBS,就得到10uM的工作液，再加1ml细胞悬液,就得到5uM/L的终浓度。 CFSE增殖实验 一、原理 荧光染料CFSE， 也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester） 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。 因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。 二、CFSE配制 用DMSO溶解成5 mmol/L的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μmol/L的工作液备用。CFSE试剂盒内有一小瓶CFSE（A试剂）标明500ug ，另有一小瓶DMSO（B试剂），500ug CFSE溶解于180ul DMSO即是5mM/L stock solution。 三、CFSE标记细胞 制作细胞悬液，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10 min，用40%体积的冷小牛血清立即终止标记10min。 离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。 CFSE的浓度国外报道从0.5uM~20uM都有，建议终浓度为2.5-5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时要经常摇匀。