dna提取实验步棸.docVIP

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。 （2）转入2ml 离心管中（转2管 或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm离心5min,弃上清收集沉淀。 （3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀 （4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃ （4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。 （4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。 （6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。 （7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ， 12000 rpm离心 ,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 （8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。 （11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。 （12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。 （13）-20℃ 1.3.2 菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增 （1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R： 5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC夹。 （2）反应体系（25 μl）： gDNA 0.5μl V3F 2.5μl V3R 2.5μl Taq buffer（Mg2+ free） 2.5μl MgCl2 2.5μl dNTPs 0.5μl Taq酶 0.5μl ddH2O 13.5μl Total 25μl 其中，所有样本gDNA在PCR扩增前均稀释到40ng/μl，即每个反应体系中加入的gDNA均为20ng。 （3）反应条件 首先采用Touch-down程序：94℃，3 min预变性；94℃，1 min变性； 65℃，1 min退火；72℃， 1 min延伸，之后每两个循环退火温度就下降1℃，直到退火温度降到55℃，再以此为退火温度循环4次；72℃，5 min延伸；4℃，10min。随后通过对PCR产物进行Recon-condition PCR去除嵌合体以及异源双链的影响：94℃，3 min预变性；94 （4）扩增产物检验：将扩增产物上样于2%琼脂糖凝胶［9］Gel Red染色，于1×TAE缓冲液中150V电泳30min，以2000bp DNA marker为Marker，使用凝胶成像系统Syngene进行检验。 1.3.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 以下操作均按照DGGE仪The DCodeTM Universal Mutation Detection System说明书进行。 DGGE凝胶制备： （1）用洗涤液仔细清洁矩形玻璃平板，横竖分别擦洗三遍，随后用去离子水将其彻底漂洗干净。操作时须带手套，并且只能握持玻璃平板的边缘，以防止玻璃平板的灌胶面受到污染。 （2）将较大的玻璃平板平放于工作台上，将相同厚度的两块垫片分别放置于玻璃平板左右两短边上，然后将较小的玻璃平板放置于垫片上，同时使两块玻璃平板的底部对齐，从而在两块玻璃之间形成灌胶夹层。 （3）将夹层钳放置于玻璃平板两短边上，调整位置使两块玻璃平板嵌入夹层钳的槽口，随即旋紧夹层钳的螺杆将玻璃平板夹紧。 （4）将上述装置放置于灌胶支架的对齐插槽中，使较小的玻璃板面向操作者。松掉夹层钳的螺杆，在两块玻璃平板之间插入比齐卡并进行适当调整，使垫片和玻璃平板及夹层钳平行。 （5）取出比齐卡并检查，如果各部件已经对齐且密封性良好则将夹层钳螺杆旋紧。否则重复步骤4-5。 （6）将灰色海绵放置于灌胶支架前插槽上，将步骤5中准备好的装置放置于海绵上，同时使较小的玻璃板面向操作者。然后将其固定。 （7）分别将两注射器标记为LO（低浓度溶液）和HI（高浓度溶液），并分别与15.5cm的聚乙烯管相连，同时将其放置于梯度形成系统的正确位置，使之能与该系统的杠杆正确连接。 （8）在梯度形成系统上设置进样体积，本实验选用16×16cm（1mm厚）凝胶，故将进样