DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤.docVIP

DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。4、37％甲醛。三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间1小时。四、银染：1、固定液固定10m。2、水洗2m x3次。3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。4、水洗 20秒x2次。5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。6、水洗若干次，终止显色。电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。银染后胶面积将膨胀10％。在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验测序凝胶的银染　　染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 　　　　1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 　　　　2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 　　　　3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 　　　　4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 　　　　5. 凝胶显影：　　　(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。　　　(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注重，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。　　　(3). 马上将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 　　　　6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 　　　　7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。　　8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。经验分享：（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10％的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。可提前配制，室温放置。（2）染色液：我们用的是0.1％的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。（3）显影液：用10％碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。这一步很重要，假如没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。因此在固