分子伴侣在胰岛素生产中应用.ppt

分子伴侣理论在制造胰岛素中的应用   主要内容 胰岛素的生产 胰岛素的质量控制 探讨 胰岛素制造的历史进展 年代 胰岛素种类 主要分离纯化方法 胰岛素纯度 20年代至40年代 动物胰岛素 结晶和重结晶 约80% 50年代至70年代 动物胰岛素 常规层析法 离子交换层析 分子筛 约95% 80年代至90年代 重组人胰岛素 生产型高效液相层析（HPLC）应用于胰岛素纯化 99% 90年代末至今 胰岛素类似物 表达系统的改进 分子伴侣应用于胰岛素生产 99% 将来 吸入胰岛素、开发胰岛素、基因治疗…… 重组人胰岛素表达方法的进展 80年代初，A、B链分别表达，分别纯化 80年代末：胰岛素原法 90年代：分子伴侣理论的应用 A、B链分别表达法 胰岛素原法 胰岛素原法的缺点 工艺复杂 复性率低：人胰岛素原有6个巯基要形成3个二硫键，有15种可能的组合，其中只有一种构象具有活性 人体内胰岛素表达图示 分子伴侣(Molecular Chaperone) 分 子 伴 侣: 是一类蛋白质,其功能是帮助新合成 的蛋白质形成正确的二硫键及正确的 构象。(全过程称为蛋白质复性) 分子伴侣分为: 分子间伴侣和分子内伴侣； 二 者 区 别: 分子间伴侣和被复性的蛋白质没有化 学键连接;而分子内伴侣则是和被复性 的蛋白质通过共价键连在一起,待复性 完毕后再切开。 甘李药业分子内伴侣理论在胰岛素生产中的应用 复 性 融合蛋白 酶 切 A链 B链 分子内伴侣 分子内伴侣 分子内伴侣在胰岛素和类似物生产中的作用 保护胰岛素在大肠杆菌内不被分解 提高胰岛素表达量 提高复性收率 简化胰岛素和类似物的生产步骤 甘李公司生产工艺和国外公司的比较 国外公司工艺 无C肽胰岛素原融合蛋白 发酵 正确构象无C肽胰岛原纯品 胰岛素粗品 胰岛素纯品 复性 酶切,解离A、B链 纯化 甘李公司工艺 正确构象无C肽胰岛原粗品 纯化 共31步 共17步 Drug Biotechnology Regulation edited by Yuan-yuan H. Chiu, John L. Gueriguian P221-262 Production-Scale Purification Processes Walter F. Prouty Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana 引自 判别胰岛素质量的标准 通用标准（药典标准） 纯度标准－胰岛素制造过程中的金标准 项目/标准依据 欧洲药典标准 美国药典标准 甘李公司标准 相关物质 不得过2.0%(包含A21) 不得过2.0%(包含A21) 不得过2.0%(包含A21) 高分子蛋白 不得过1.0% 不得过1.0% 不得过1.0% 细菌内毒素 不得过10EU/mg 不得过10EU/mg 不得过10EU/mg 微生物限度 不得过100CFU/g 不得过300CFU/g 不得过100CFU/g 宿主蛋白 不得过10PPM 不得过10PPM 不得过10PPM 残余DNA 无具体量的要求 无具体量的要求 不得过10ng/剂量 效价测定 按照干燥品计算,含人胰岛素不得少于27.5IU/mg 按照干燥品计算,含人胰岛素不得少于27.5IU/mg 按照干燥品计算,含人胰岛素不得少于27.5IU/mg 判别胰岛素质量的标准 通用标准（药典标准） 纯度标准－胰岛素制造过程中的金标准 胰岛素制造的历史进展 年代 胰岛素种类 主要分离纯化方法 胰岛素纯度 20年代至40年代 动物胰岛素 结晶和重结晶 约80% 50年代至70年代 动物胰岛素 常规层析法 离子交换层析 分子筛 约95% 80年代至90年代 重组人胰岛素 生产型高效液相层析（HPLC）应用于胰岛素纯化 99% 90年代末至今 胰岛素类似物 表达系统的改进 分子伴侣应用于胰岛素生产 99% 将来 吸入胰岛素、口服胰岛素、基因治疗…… 用HPLC测定胰岛素效价误差小于5% （传统的小鼠惊厥法，误差20%） HPLC能检测出小于0.1%的杂质 分析型高效液相层析（HPLC） 是胰岛素质量控制的最重要的工具 分析型HPLC 不同厂家胰岛素及类似物HPLC图谱比较原图谱 不同厂家