荧光标记的siRNA使用说明.PDF

荧光标记的siRNA使用说明 一、荧光标记的siRNA 转染效率的高低可以通过观察荧光标记(FAM、CY3、CY5)的siRNA转染 细胞后的荧光强度判断。荧光标记的siRNA转染细胞后，可以用荧光显微镜、 激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测，确定转染是否有效及转染条件。荧光 标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记杭体)来追踪转 染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。 二、使用荧光标记的siRNA检测转染效率 荧光标记的siRNA的溶解及保存 1.由于OligoRNA是很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开离心 管前先离心，10000 rpm，2 min然后再慢慢打开管盖，溶解时加适量DEPC水后 盖上管盖，振荡溶解。 2. 需要浓度20μM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？ 1 OD的siRNA，加入125μl附送的DEPC水,溶解后终浓度为20μM 。 3.贮存和稳定性：-20℃ ,避光保存，冻干粉或液体。液体(贮存浓度为20μM) 避免反复冻融，GenePharma保证在上述条件下siRNA oligo冻干粉的稳定性可达到6 个月，液体状态下建议3个月内使用完。 转染 1.使用lipo fectamin2000转染的步骤(以贴壁细胞为例，仅供参考) a. 以24孔培养板操作为例(其他孔板各种的试剂用量，请参照“Lipofectamine2000 5 manual”) ，转染前一天，将0.5-2×10 个细胞接种于培养板中，每孔中加入约 500μl含血清的完全培养基，使转染时的细胞密度能够达到70% ； b.取1μl/孔Lipo fectamine2000(使用前轻轻摇匀) ，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min ; c.取2μl荧光-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释，轻轻混和 均匀; d.稀释的Lipofectamine2000(步骤b)经过5min的孵育后，与稀释荧光-siRNA(步骤 c)轻轻混和，室温静置20min ，以形成荧光-siRNA-转染试剂混和物，如果溶液 出现浑浊，属于正常现象，不会影响转染效果。 注意:稀释的Lipo fectamine2000尽量在25min之内和稀释的荧光-siRNA混和， 如果放置时间过长，可能导致转染试剂活性的降低; B007-V002 e. 将荧光-siRNA-转染试剂混和液(d)加入含有细胞及培养液(约含400μl)的孔 中，轻轻摇晃孔板，使混和； f. 在37℃的C0 培养箱中培养，4-6h后可将培养基换为含血清的完全培养基(该 2 步骤可以省略）； g. 转染6h后即可检测转染效率:流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜 等。�� 转染操作注意事项 1.荧光-siRNA的转染过程和普通siRNA是一样的，注意整个实验过程要尽量避 光，建议转染时室内和超净台内不要开灯; 2.保持荧光-siRNA管外有锡纸包裹，在静置lipo-siRNA过程中尽量避光； 3.转染操作尽量快，操作时间尽量短，操作完毕请尽快将培养板放到培养箱； 4.一般来说，使用Lipofectamine 2000作为转染试剂，4-6h就可以保证siRNA转染 进入细胞。因此转染效率的检测可以在转染后6h(转染过程完成)进行。�� 观察与检测 1.检测方法:荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪 2.荧光显微镜观察注意事项(流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测请参照仪器 说明书) a. FAM是一种绿色荧光基团，由蓝光激发，激发波长480nm ，发射波长520nm; CY3是一种红色荧光基团，由绿光激发，激发波长545nm，发射波长568nm; b. 使用Lipofectamine 2000转染后6h就可以检测，检测前细胞处理等操作都必须 避光 ！对于检测的时间要求相对不是特别严格，成功转染的细胞如果没有受到强 光刺激的话，荧光一般不会消失，我们建议尽量在转染后24h内完成检测; c. 确保熟悉荧光显微镜操作。建议检测时，可以先使光路先对准没有转染荧 光-siRNA的孔，调好焦距打开激发光，