实验二分子生物学实验PCR技术.pptVIP

Company LOGO 《分子生物学实验》 实验二　PCR技术 分子生物学实验 一、实验目的 了解PCR的基本原理，学习PCR的基本操作技术。 分子生物学实验 PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个DNA分子。其中目的片断为2n-2n，非目的片断为2n。 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction , PCR) 分子生物学实验 PCR技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 分子生物学实验 二、实验原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 1.实验原理 分子生物学实验 分子生物学实验 PCR技术的特点 1）高度的灵敏性（一般100ng DNA模板/100?L。） 2）特异性 引物 引物 3）操作简便易行 4）用途广泛 分子生物学实验 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3′端为关键碱基；5′端无严格限制。 分子生物学实验 3.PCR的反应体系和方法 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1）反应体系 分子生物学实验 待扩增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液 +两条引物+ Taq DNA聚合酶 +Mg 2+ 95℃变性30″ 60℃退火30″ 72℃延伸1′ 双链DNA变性， 形成单链模板DNA； 使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上 在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→ 3’方向延伸，合成新生DNA互补链。 25～30 2）PCR全过程 分子生物学实验 1）PCR反应成分 （1）模板（单、双链DNA均可一般100ng DNA模板/100?L）。 （2）引物浓度（ 0.1-0.5 ?mol/L） （3）TaqDNA聚合酶（ 0.5-2.5 U/50 ?l) （4）dNTP（dNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等） （5） Mg2+（ 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 4 .PCR反应条件 分子生物学实验 (1)变性 2）循环参数 使双链DNA解链为单链 94 ℃ 20-30秒 （4）循环次数 (2) 退火 40℃～60℃ 20～45秒 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 1分钟 延伸时间由扩增片段长度决定 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 分子生物学实验 经典循环参数（500bp以内） 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min