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非编码RNA与荧光定量技术 北京阅微基因技术有限公司 荧光定量PCR技术原理 荧光定量平台应用 荧光定量分析方法 实验流程 成功项目案例 实时荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术原理  实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescencequantitative PCR，qPCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。  荧光定量PCR所使用的化学荧光可分为两种： 特异性荧光标记： TaqMan探针 非特异性荧光标记：SYBR染料 SYBR Green 工作原理 游离状态下，荧光物质发出微弱荧光。 与双链DNA有高亲和力，渗入双链DNA后荧光增强1000倍。 延伸时，荧光物质不断渗入，荧光信号累积，与产物量成正比。 延伸结束时，采集荧光信号。 TaqMan探针工作原理 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。 SYBR Green与TaqMan探针比较 SYBR GREEN TaqMan探针 优点 缺点 优点 缺点 与所有双链DNA结合， 可能存在假阳性； 使用方便 特异性强 成本高 准确度高 需要设计特异性探 成本低 引物要求高 针 通用型性好 不能用于多重反应 可做多重PCR 引物设计难度高 荧光定量PCR技术原理 系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR常用的四个概念 扩增曲线、基线、阈值、CT值 扩增曲线及扩增曲线的两种形式 左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反 映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定 阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲 线可以根据实验的需要相互转换 荧光定量PCR技术原理 基线、阈值线及CT值 • 基线（baseline）：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号； • 荧光阈值（threshold）：扩增曲线上人为设定的一个值，位于指数增长期。  缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍； 手动设置时，要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值； 指数期的最初阶段。 • CT值：PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过 的 扩增循环数。 荧光定量PCR技术原理 荧光定量平台的应用 荧光定量平台的应用  检测不同样本间基因表达量的差异； 主要通过相对定量的方法实现：如：mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA的相对定量、 CNV检测等。  检测样本内基因的拷贝数、病毒数量及细菌数量等； 主要通过绝对定量的方法实现。  SNP分型检测：TaqMan探针法、HRM法；  验证southern结果；基因芯片（DNA杂交）。 mRNA和microRNA简介 MicroRNAs （miRNAs）是一类长度约19–