分子生物学检测与动物试验.pptVIP

节 分子生物学检测  一、细菌DNA由四个碱基组成： 　　鸟嘌呤（G）　　　　腺嘌呤（A） 　　胞嘧啶（C）　　　　胸腺嘧啶（T） 　　严格的碱基配对： 　　A＝T G＝C 　　常以G＋C碱基对的摩尔百分比来测定细菌DNA四个碱基对的含量来鉴定细菌。 二、细菌DNA提取过程 (一)细菌的培养及细菌收集 　 细菌培养：液体培养，固体培养 　 细菌收集：一般要求收集2-3克湿菌体 (二)细菌破壁 　 1. 超声波破壁法 2. 氧化铝磨碎法 3. 反复冻融法 4. 化学试剂破壁法，十二烷基磺酸钠“SDS” 5. 溶菌酶溶解法 6. 其他方法：细菌研磨法、玻璃珠研磨法。 三、细菌DNA的提取方法 (一)Marmur氯仿提取法 湿菌体2~3克 离心洗涤一次 悬浮于30~35ml 250g/L的SDS 于60℃加热10分钟，使之破裂 加入5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L) 置入带塞的玻璃溶器中，加入等体积的氯仿 - 异戊醇(24:1 v/v) 5000~10000 r/min 离心5min 分层 0.1mol/L NaCl 50ml溶液 0.1mol/L EDTA pH8.0 溶液 冷却到室温后 振荡20min 上　层 水相 含核酸 中　层 蛋白质 下　层 氯仿- 异戊醇 吸出上层含核酸的水相 加入二倍体积的乙醇 用搅拌棒搅拌 用棒卷出丝状DNA，靠壁挤干 再充分溶于10~15ml 0.1 SSC (0.15mol/L NaCl ~0.15mol/L柠檬酸三钠) Ph7.0±0.2 简称SSC 稀释10倍为0.1SSC 待全部溶解，再用10SSC(1SSC浓缩10倍) 调整到约1SSC的浓度 再与等体积的氯仿-异戊醇一起振荡15min 重复一次进行清除蛋白，直到看不见变性蛋白为止 注意： 1. 被溶解的细菌浓度不能太低。 2. SDS为阴离子去污剂，各厂家、批号、等级差异较大。 3. 离心分层后，取水相液体要准确。 (二)细菌DNA中G+C摩尔百分比测定 　1. 化学方法　用电泳和层析等技术 　2. 物理方法　用热变性温度(目前常用方法) 　　G+C摩尔百分比测定，是细菌分类鉴定的一种重要方法。缺点：不能表达出DNA碱基的排列顺序。 核酸杂交技术 　　核酸杂交技术（technique of nucleic acid hybridization）是由现代分子生物学的重要方法之一。 　　是用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法。 一、核酸探针(DNA探针) 　　就是指带有标记物的，能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸序列片段。 　　(一)核酸探针的种类 根据标记方法 放射性探针 非放射性探针 根据核酸性质 DNA探针 CDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 1. NDA探针 　　DNA探针是目前最常用的核酸探针，因具有三 大优点： 这类探针克隆在质粒载体上，可无限繁殖，取之不尽； DNA探针与RNA探针相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性； DNA探针标记方法较成熟，制备方法简便。 　　DNA探针一般长度在几百碱基对，可以是双链DNA，也可是单链DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分序列。 2. CDNA探针 　　CDNA是指互补于mRNA的DNA分子(complementary DNA)， CDNA是由RNA经反转录产生的，这种DNA探针不含有内含子序列，尤其适用基因表达检测。 3. RNA探针 　　是一类很有前途的核酸探针，常用细胞mRNA和病毒RNA， 具有高杂交效率。但易降解，标记复杂之缺点。 4. 寡核苷酸探针 　　根据某一特殊核酸序列，选择其中最稳定区域，经人工合成，为18~30个碱基，能识别一个碱基。 具有以下特点： 由于链短，序列复杂度低，分子量小，杂交耗时短； 一次性可合成大量寡核苷酸探针； 短探针，碱基错配能降低杂交体的Tm值。 二、标记物 　　32P 　半衰期 　14.3d 　　35S 　半衰期 　87.1d 　　14C 半衰期 　　125I 　 半衰期 　 60d 　 三、基因重组载体 　　载体的功能是将一个外源基因导入受体细胞 　　具体的条件 　　1. 其本身是复制子，能自我复制。 　　2. 分子量小，带有选择标记。 　　3. 对几种限制性内切酶有单一切点。 　　4.并有一定非必要区，允许外源基因插入。 Southern 印迹杂交 两个主要过程： 　　一是将待测核酸分子通过一定方法转移并结合到一定的固相支持物上(即印迹，blotti