短柄草农杆菌转化流程.docVIP

PAGE PAGE 1 短柄草 TOC \o 1-3 \h \z \u 种植短柄草 1 诱愈以及继代培养 1 电转 农杆菌及存菌 2 农杆菌侵染 2 筛选、再生及生根 2 流程图 2 各种培养基及所用药品的配方 3 培养基（每L） 3 农杆菌培养基（MG/L） 3 幼愈培养基（CIM） 3 再生培养基（REM） 3 生根培养基（MS） 3 药品 4 种植短柄草 取种子剥去外稃，置于培养皿中（内置蒸馏水湿润的滤纸）。然后将培养皿置于4℃冰箱春化2~3周 土:基质:蛭石=2:2:1掺和，加入适量缓释肥。浇水渗透之后，将春化好的种子种于土中。 培养条件： 白天20小时：全光照，24℃，湿度40﹪ 夜晚4 小时：无光照 ，18℃，湿度60﹪左右。 前几周苗子小可以在培养箱里养苗。几周之后，苗子长壮了，便可以搬到温室。 诱愈及继代培养 取种子：拨取灌浆刚刚饱满的种子（手捏带着外稃的种子感觉不太坚硬也不太柔软，拨取稃片时，内稃应该比较容易剥下，难剥下内稃的种子大部分都长过了）。 消毒：用消毒液（90﹪有效cl的NaClO 2.5ml+10﹪ triton100x 0.5ml + 水 47ml）将种子浸泡5min，然后用灭菌水彻底清洗2次（清洗过程中要注意防止再次染菌）。 将洗好的幼嫩种子放于培养皿中（最好有水浸泡，防止过干，以至于难于取幼胚），用体式显微镜（提前紫外酒精灭菌）拨取晶胚（0.3mm晶胚的幼愈率90﹪，0.3-0.7mm晶胚幼愈率50﹪）。 将晶胚（见下图）放于幼愈培养基（CIM）上，调整使其盾片向下，然后用封口膜封好。 幼愈4周，前五天注意观察，防止其染菌。（幼愈和继代培养的条件都为：28℃，暗培养）。 四周后，在体式显微镜下，从诱导的愈伤上挑取质量好的淡黄色胚性愈伤（见上图），将其转移到新的幼愈培养基上做继代培养，培养两周。 两周后，从继代愈伤上再挑取质量好的胚性愈伤，将其转移到新鲜的幼愈培养基上，做第二次继代培养，培养一周。 一周后，将其从培养基上取下，准备做农杆菌侵染。 电转农杆菌及存菌 电转准备：农杆菌感受态、质粒、75%ETH浸泡的电转杯、电转仪、无菌水、移液枪、枪头（2ul/1000ul）、冰盒、50ml培养管2个、MG/L(或LB)培养液。 将装有感受态、质粒的离心管置于冰盒上 清洗电转杯：将无菌水倒入50ml离心管中，用1000ul的移液枪清洗电转杯3~4次 吸2ul质粒于100ul农杆菌感受态的菌液内部，吹吸均匀。 拌匀的菌液吸入电转杯中，盖好盖子，放入电转仪相应位置（金属片位于左右两侧），运行。（电转参数：1600V、500Ω、50uF） 电转结束，电转杯中立刻加入MG/L(或LB)培养液900ul，吹吸均匀后，转入离心管中。 28℃ 将摇好的菌液均匀划在MG/L（或LB）培养基上，28℃ 挑单菌落于加有质粒抗生素（如卡那霉素）的MG/L（或LB）培养液中，28℃ 菌液与混合液（加有等体积甘油的MG/L或LB溶液）按1:1的比例存于2ml离心管中，-80℃ 农杆菌侵染 提前两天划农杆菌菌液于MG/L 培养基上，28℃暗培养2d 转化当天，用蓝枪头将长好的农杆菌从培养基上刮下，涂于50ml 菌体培养管（高压灭菌）中，用少量液体的幼愈培养基（CIM）重悬保持较高的初始浓度，然后用CIM调其OD值，使其OD600=0.6。然后根据转化液体积加入乙酰丁香酮（AS）和PE/F68（工作浓度分别为：200uM和0.1﹪）。 将愈伤从培养基上取下，集中到另一个50ml 菌体培养管中（高压灭菌），然后加入步骤2中准备好的转化液，浸泡5分钟。（转化液要完全浸没愈伤，一般100个愈伤用10ml转化液就足够了）。 用镊子夹着对折好的滤纸（高压灭菌）过滤，将转化液与愈伤分离，然后愈伤转移到放有干燥灭菌的含滤纸的平板里。干燥一下。 最后将愈伤分装于几个平板里（含滤纸），尽量匀开，每板约60个愈伤。22℃ 筛选、再生及生根 1、三天后，将愈伤从滤纸上转移到含抗生素的CIM上进行筛选，28℃暗筛选1周 2、1周后，选取质量好的黄色或淡黄色愈伤，将其转移到新的含相同抗生素的CIM上，再次筛选， 28℃暗筛选2周 3、两周后，将在筛选培养基上生长比较健康（黄色，未褐化）的愈伤转移到再生培养基（REM）上，由于营养物质有限，所以每个再生培养基所容纳的愈伤有限。一般将培养基平分为8个区域，每个区域所容纳的愈伤都是来自步骤2中同一格的。 其培养条件为： 白天16小时：全光照， 28℃ 夜晚8 小时：无光照 ， 28 4、大约2~4周后就可以看到再生出的幼嫩叶片。 5、将再生出来的有嫩叶连同其所属愈伤小块