酶的分离工程3教学课件.ppt

沉降分析图谱上呈现一个峰。如果蛋白质样品不纯而含有几种蛋白质时，在沉降分析图谱上就有几个峰出现。 二．电泳（实验室常用方法） 使用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) (一)PAGE的优点： 1．聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的多聚体。调节单体浓度 或单体和交联剂的比例，就能得到孔径不同、范围广 泛的凝胶物质，而且重复性好； The migration of nine proteins ranging from 94 kDa to 14.4 kDa in SDS gels of varying acrylamide concentrations. 2．化学性能稳定，与被分离物质不起反应，对温度和 pH变化不敏感； 3．聚丙烯酰胺凝胶是-C-C-C-C-C-连接的多聚体，侧 链除带有不活泼的酰胺基外，不带有任何其它离子 基团，故无电渗作用(电场中，液体对于固体支持 物的相对移动) ； 4．聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，弹性大，无色透明，有 利于电泳后进行各种理； 5．设备简单，所需样品量少（1-100μg），分辨率较 高。 （二）聚丙烯酰胺凝胶的聚合 1．一般过程 由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（又称为共聚体） 的N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂 的作用下聚合交联而成的三维网状结构； 2．化学聚合 ①加速剂和催化剂：以过硫酸铵[(NH4)2S2O8](简称APS) 为催化剂，以N, N, N/, N/—四甲基乙二胺 [(CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2]（简称TEMED）为加 速剂； ②过程 a．TEMED的碱基催化APS立即产生硫酸自由基： S2O82-→2SO4?-。 b．硫酸自由基的氧原子激活丙烯酰胺单体连接成单体长 链。 c．交联剂Bis将单体长链连接成网状结构。 3．光聚合 催化剂：核黄素。是一个由光激发的催化反应过程。 在氧及光照条件下，核黄素生成含自由基的产物。 4．分离效应：电荷效应、分子筛效应及样品的浓缩效 应。 5．SDS原理： SDS：断裂分子内和分子间氢键，使分子去折叠； 强还原剂：使二硫键断裂。 蛋白质样品在100℃用SDS和还原试剂处理3~5分钟后解聚成亚基 Bio-Rad公司Mini-垂直板电泳倒胶槽与电泳槽 倒 胶 槽 电 泳 槽 植物叶片全蛋白的SDSE. coli蛋白的SDS烟草类囊体膜蛋白的尿素-SDS.活性染色 原理：利用酶本身的催化活性，将酶促反应直接或间接地与可以生成有色物质的化学反应相偶联，从而染色显示酶蛋白所在位置。 超氧化物歧化酶（SOD）的活性染色 电泳分离的凝胶经含核黄素和硝基氮兰四唑（NBT）的溶液浸泡后，再经光照，核黄素光化学还原后生成的O2·-可以使NBT还原生成蓝色化合物。而SOD可以清除O2·- ，这样，在有SOD的凝胶的相应位置由于没有O2·-从而不能使NBT还原产生蓝色，从而在蓝色背景上显示出含有SOD的空白条带。这种染色方法可以检测出纳克级的SOD。 三．免疫技术 （一）免疫扩散 琼脂免疫双扩散法检验酶的纯度 Ab: 抗血清； Ag 1~4: 不同纯度的酶样品 （二）免疫电泳 四．恒溶度法 原理：纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解 度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量。 方 法 备 注 超速离心 对检测少量杂质（5%）时不太满意，当存在络合-解离体系时也会出现问题。 电 泳 必须在多种pH条件下进行，在单一pH值下，两种酶可能一起移动。 SDS检测与亚基分子量不同的杂质的一个主要方法，对检测制备物中蛋白水解酶的水解作用非常有用，酶由不同亚基组成时，会出现多条区带。 等电聚焦 检测杂质的极灵敏方法，有时当存在表观异质时，会出现假象。 N-末端分析 应该指明只存在单一多肽链，有些酶具有封闭的N-末端，另一些酶则由二硫键连接的几条肽链组成。 免疫技术 高度的专一性，但抗血清的制备较为麻烦 恒溶度法 必须要在严格的条件下进行，且要确保条件不发生改变。而且对样品的需要量大。 第五节 浓缩与干燥 (P151) 一．浓缩： 1．概念：从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而 成为高浓度溶液的过程—液体酶制剂。 2．方法：留心，过滤，膜分离，沉淀分离，层析分 离，吸水剂等 3．廉价而实用的浓缩方法—蒸发浓缩 加热：酶在高温下不稳定，易变性失活。（少用） 减压