酶活性测定的主要影响因素及控制.pptVIP

2.3 需要注意 某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。 2.4 正向反应与逆向反应 一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。 除原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向外，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。 例如， CK的测定普遍采用逆向反应，因其逆向反应是正向反应的6倍，而且受影响因素少。 2.4 正向反应与逆向反应 LDH测定的选择目前尚有争议。 国内多采用正向反应（L→P），与IFCC在2001年发表的操作手册一致。 正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低廉，稳定性好。 国外常用方法曾是逆向反应（P→L）， 反应速度是正向的3倍，成本也较低。 2.5 检测试剂的干扰作用 试剂酶的污染。 组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。 底物的非酶反应。 很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。 如碱性磷酸酶（ALP）测定 解决的方法 是通过试剂空白管检出并加以校正。 选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量好的试剂。 3. 仪器因素的影响及控制 3 仪器的影响因素 加样系统 加样的准确性、重复性和携带污染； 反应系统 反应杯的形状、表面和携带污染； 反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围； 搅拌和清洗机构的效果和携带污染； 检测系统 光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等均会造成结果的偏差。 3 仪器影响因素的控制 在日常工作中，除常规做好仪器和设备的正确使用和维护外， 重点应注意仪器的校准问题。 3.1 酶活性浓度的计算公式 摩尔吸光系数 ? 和系数 K 均为常数， ? 和 K受仪器诸多因素的影响， 如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。 ? 和 K 可用校准物定期校正。 3.2 校准物 可用作酶活性测定用的校准物分两类。 一类是产物的基准物质， 如对硝基酚、对硝基苯胺等， 用于校准仪器的 ? 值（摩尔吸光系数）。 另一类称酶校准物（Enzyme calibrator）， 多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近， 用于校准仪器的 K 值（酶活性浓度定量系数）。 3.2 校准物 国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。 各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。 常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。 目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。 3.3 ε的校准（340 nm波长） NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。 在340nm?的NAD(P)H的?，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的?。 NAD(P)H的ε为6220。 如果6 000ε6600为不合格，则需找维修部检查。 注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。 3.3 ε的校准（405 nm波长） 最常用的色素原为对硝基苯酚等。 对硝基苯酚在405 nm的?，可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算ε值。 对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大，则需找维修部检查。 3.4 K的校准（公式计算法） 将上述实测ε值代入K值计算公式得到校准K值外。 3.4 K的校准（酶校准物） 使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。 使用酶校准物的优点， 除具有实测ε值换算出的校准K值所具有的一切优点外， 还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。 3.4 K的校准（频率） 最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。 仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。 但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准： 试剂盒改变厂家，或者更换了批号； 仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件； 质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。 4. 测定条件与参数设置 4.1 最适条件包括 ①合适的底物和最适底物浓度； ②理想的缓冲液种类和最适离子强度； ③反应液的最适pH； ④最适反应温度； ⑤合适的辅因子、激活剂浓度； ⑥若是酶偶联反应，还需要确定指示酶和辅助酶的用量； ⑦合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期； ⑧合适的样品与反应试剂的比例； ⑨足够的检测范围； ⑩尽量去除各种抑制剂等。 4.2 反应温度 目前常规实验室越来越多的使用37℃，这更多地是从实际工作方便来考虑。 1986年以前，IFC