实验六 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素.ppt

实验三 层析技术 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素 动物医学院动物生化教研室 * 学习层析技术的基本原理 掌握凝胶层析法分离混合物的基本原理 了解凝胶层析法的分离血红蛋白的基本操作 一、实验目的 * 二、层析技术 1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因．又常称为层析法。 80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。 * 层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。 * 层析技术分类 名称 操作方式 固定相 流动相 分离依据 分配层析 纸层析 薄层层析 液体 液体 溶解度 离子交换层析 离子交换柱层析 固体 液体 带电性 静电引力 吸附层析 吸附薄层层析 气体吸附层析 固体 固体 液体 气体 吸附力 亲合层析 酶与底物 抗原与抗体 固体 液体 配体专一性 凝胶层析 凝胶过滤 固体 液体 分子大小 * 三、凝胶层析技术 概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作 为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技 术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝 胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并 最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在 柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。 * 凝胶层析的原理 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 大小分子分开： 大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。 * 固定相： 各种多孔凝胶，填充于层析柱中 流动相： 洗脱剂，缓冲液或蒸馏水 凝胶过滤所用的介质是由交联葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。 Sephadex-葡聚糖凝胶 Sepharose-琼脂糖凝胶 Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶 * 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素 原理：当含有不同大小分子的混合物经过葡聚糖凝胶（G-25）时，核黄素（黄色，分子量370）进入介质内部孔隙，而大分子的血红蛋白（红色，分子量64500）则被排阻在介质之外，从而达到分离的目的。 葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l,3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物。 * * * 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。 G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。 * 凝胶处理：溶胀、平衡 装柱前准备: 往层析柱加入2-3mL蒸馏水,以确保凝胶底部没有气泡； 装柱：垂直装柱，装柱时应注意凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。柱装好后，不管使用与否，都应有液体(与洗脱液相同)浸过凝胶表面，以免混入空气。 平衡：连接恒流泵,平衡10分钟，使洗脱液维持在3-4cm高度。恒流泵流速调整为18滴/分钟。 加样：待蒸馏水流至柱平面时（不可使柱平面干掉），靠近柱平面小心滴加1mL样品（注意尽量不要使床面搅动），待样品浸入到凝胶中后入涮洗液，待样品再次浸入加蒸馏水洗脱； 收集样品：每管收集2mL. 实验操作 * 层析装置 * 第一步：电源连接 * 第二步：装柱（垂直，正确） * 第三步：安装恒流泵 * 第四步：灌胶 * * * * 注意事项 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体