第三章 酶的分离工程教学课件.ppt

第三章 酶的分离工程 与一般的蛋白纯化过程相比较，酶的纯化过程有以下两 个独有的特点： 特定的一种酶在细胞中的含量很少。 酶可以通过测定活力的方法加以追踪。 第一节 酶分离纯化的一般原则 一．建立一个可靠和快速的测活方法 1．可靠的测活方法主要表现在方法专一、灵敏、精确和 简便上； 2．测活方法要经济； 3．测活方法要简单。 二. 酶原料的选择 选择目的酶含量丰富的原料，同时也要考虑原料的来 源、取材方便、经济等因素。 * 三．酶的提取 除了存在于液相环境或胞外酶外，一般都要选用适当 的方法，将含目的酶的生物组织破碎，促使酶增溶溶 解，最大程度地提高抽提液中酶的浓度。 四．酶的提纯 1．一般步骤 先根据酶分子溶解度的性质，选用适宜的沉淀方法 （如盐析、有机溶剂沉淀等），将目的酶分级沉淀， 制得粗酶，再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和 专一性等，应用离心、层析、电泳、结晶等方法， 将酶纯化。 * 2．评价分离提纯方法的指标 ①总活力的回收率，反映了提纯过程酶活力的损失情 况； ②比活力提高的倍数，反映了纯化方法的效率。 3．纯化过程中，应尽量避免可能招致酶变性、失活的 不利因素（热、重金属离子、蛋白水解酶、过酸或过 碱等），使酶自始至终保持天然活性构象，以达到 最佳的分离效果。 * 五．酶的纯度检验 当把酶提纯到一恒定的比活时，即可认为酶已纯化，但仍需要用电泳、层析、离心等方法，对纯化的酶进行纯度鉴定。 酶的纯度是一个相对概念，而非绝对概念。 六、酶的浓缩 尽量的去除溶剂，蒸发和干燥 七、酶的贮存 液体酶制剂与粉末酶制剂 * 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 * 第二节 细胞的破碎及酶的提取 一．生物材料的破碎 （P72） （一）机械破碎法 通过机械运动所产生的机械剪切力的作用使细胞破 碎的方法。常用的有组织捣碎机、匀浆器、细胞研 磨器或直接用研钵研磨等。多用于对动植物细胞的 破碎。 组织捣碎机 多功能食品料理机 玻璃匀浆器 * （二）物理破碎法 通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组 织细胞破碎的方法。多用于对微生物细胞的破碎。 1．温度差破碎法： 适用于较为脆弱、易于破碎的细胞 应用中最常使用的是冻融法。 此法对细胞破碎的效率不高。 * 2．压力差破碎法：对含多糖细胞壁的细胞不太适用。 3．超声波法： 高压细胞破碎器 超声波细胞破碎器 * （三）化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方 法。常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有 机溶剂和Triton, Tween等表面活性剂。 （四）酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细 胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。 * 二．酶液的提取 （P75） 1．典型的提取液的组成 提取液=离子强度调节剂+pH缓冲剂+温度效应剂 +蛋白酶抑制剂+抗氧化剂+重金属络合剂+增溶剂 2．提取液各组分的作用： （1）离子强度调节剂与缓冲剂： 作用：使酶尽可能的处于体内环境的离子强度和pH值 条件。 试剂：0.1～0.2 M的NaCl或KCl；PBS(phosphate buffer saline)或TBS(Tris buffer saline) * （2）温度效应剂： 作用：防止过冷、过热引起的酶分子变性失活。 试剂：甘油，二甲亚砜(DMSO) （3）蛋白酶抑制剂： 作用：抑制细胞破碎释放出来的内源蛋白酶 试剂：苯甲基磺酰氟(PMSF)，各种蛋白酶抑制剂 * （4）抗氧化剂： 作用：防止酶被氧化而失去活性。在酶的提取过程中， 酶容易氧化变性失活是由于和氧的接触以及体内原 有抗氧化成分的稀释而减少。 试剂：β-巯基乙醇(ME)，二硫苏糖醇(DTT) * （5）重金属螯合剂： 作用：避免金属离子引起的酶蛋白变性失活，但应注意 螯合剂同时也能使金属蛋白酶失活。 试剂：EDTA(对大多数金属离子有非特异性的亲和力)， EGTA(对Ca2+有很强的亲和性) * （6）增溶剂（去垢剂）：使膜蛋白溶解。 ①结构：由疏水性尾部和亲水性头部组成； ②特性：形成亲水性头部向外的分子团结构，溶