实验四-玉米种子盐溶蛋白凝胶电泳.pptxVIP

实验四 玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定;一、目的要求 了解玉米种子盐溶蛋白提取方法、电泳程序、染色和鉴别方法。 二、原理和依据 利用不同带电质点在一定电场中的迁移速度不同进行分离，凝胶电泳除了电荷效应，还有分子筛效应和PH梯度等。;三、材料、仪器和试剂 材料： 玉米种子。 仪器： 电泳仪，电泳槽，离心机，离心管，1/1000电子天平或分析天平，样品钳，广口瓶，移液管及移液管架，微量进样器（1-50μl），注射器等电泳用品。 试剂： 丙烯酰胺（Acr），亚甲基丙烯酰胺（Bis），甲酸，甲酸钠，过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED），NaCl，蔗糖，甲基绿，甘氨酸，考马斯蓝R250，三氯醋酸（TCA），乙醇（96%），乙酸（99%）等。所有化试剂都需是分析级或以上等级。 ;四、方法和步骤 1．溶液配制 （1）凝胶溶液的配制 ①贮备液A（分离胶贮备液）：称取90g Acr，3g Bis，加入去离子水350ml，搅拌至完全溶解（约30min）后定容到500ml，放入棕色瓶中低温保存。 ②贮备液B（分离胶缓冲液）：吸取含量88%的甲酸0.427ml，称取甲酸钠（含2个结晶水）1.0456g，加入50ml去离子水，搅拌混匀，并定容到100ml，并调节pH至3.2，倒入棕色瓶中低温保存。 ③贮备液C（分离胶化学聚合催化剂1%APS）：称取2gAPS，加入100ml去离子水，搅拌至完全溶解，并定容到200ml，倒入棕色瓶中低温保存，仅能保存1周。 ;④贮备液D（浓缩胶贮备液）：称取9.3gAcr和0.31gBis，先加入30ml去离子水，搅拌至完全溶解，再定容到50ml，倒入棕色瓶中低温保存。 ⑤贮备液E（浓缩胶缓冲液）：吸取含量为88%甲酸0.218ml，称取甲酸钠0.5228g，加入30ml去离子水溶解，并定容到50ml，调节pH至5.6。倒入棕色瓶中低温保存。或者先溶解甲酸钠，然后用甲酸滴加，调节pH至5.6。 ⑥贮备液F（浓缩胶聚合催化剂1%APS）：称取1gAPS，先用60-70ml去离子水溶解，搅拌至完全溶解后定容到100ml，倒入棕色瓶中低温保存。仅能保存1周。 ⑦贮备液G（凝胶聚合加速剂TEMED）：吸取1mlTEMED，加去离子水1ml溶解，放入冰箱低温保存。;（2）样品提取液的配制 称取0.2928g NaCl，20g蔗糖和0.04g甲基绿，加去离子水溶解，充分搅拌至溶解，定容到100ml。（稀盐溶液） （3）电极缓冲液配制 吸取含量为88%甲酸溶液8.54ml，称取甘氨酸6.006g，先用1600ml去离子水溶解后定容到2000ml，混匀并调节pH至3.45备用，可重复使用5次（或先将甘氨酸溶解，然后滴加甲酸，调至pH3.45）。 ;（4）蛋白质染色液配 称取1g考马斯亮蓝R250，先用95%酒精溶解至100ml，另用去离子水配制10%（W/V）的TCA溶液。使用之前吸取1%考马斯亮蓝液3.5ml于100ml的10%TCA溶液中，配成一块凝胶板染色液。 注：该染色液具有固定和染色两种功能。必须在放入凝胶染色前再混合。 （5）凝胶贮备液配制;2. 操作技术 （1）样品制备： 取单粒玉米种子，在单粒样品磨碎仪上粉碎后，收集到1.5ml离心管中，按约1∶1的量用洗瓶或滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后，再摇一次，5000rpm离心15min，取上清液点样。在做玉米品种测定时，可不用离心，自然沉降30min后，取上清液即可，该样品浸提在冰箱中进行更好。点样后样品可放入冰箱中保存两天，再电泳时，只需将样品重新摇动一次就行。一般加样30-50ul。;（2）凝胶制备: ①电泳槽准备： 垂直板夹芯电泳槽安装比较简便，先将玻璃装入橡胶封条中，然后插入有机玻璃制成的电泳槽中，拧紧螺栓，固定好成胶模。 此步操作要注意玻璃板必须洗干净，而且要干燥，手指不能接触玻板表面，操作时可戴细纱手套用或用手拿住玻板棱，另外，胶模在电泳槽中要放水平，位置合适，以防漏水。 ;②配胶： 从冰箱中取出凝胶贮备液，根据电泳槽的大小，按表4中的比例取出一定体积的分离胶各贮备液混匀，同样取出浓缩胶溶液，混匀，G液先不加入，将各贮备液再放回冰箱。 注意取贮备液用的移液管要分别使用，不能混用。;③封底缝： 为了使胶和下槽相通，成胶模下边有一条底缝，灌制分离胶前必须先将底缝用胶封住，根据底缝大小，取适量分离胶混合液，加入适量G液（用微量注射器加入），然后迅速摇匀，沿下槽玻板外壁倒入，将底缝封住。将电泳槽在实验台面上振动一下，使底缝封平。对于多个电泳槽的封底缝可用同时进行。一般5-10min，分离胶就会聚合将底缝封住。 ;④灌分离胶： 封底后，用滤纸条插入两玻板之间，吸去因成胶而析出的水，从分离胶混合液中取出一块板的