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第四章 利用基因工程技术表达蛋白质 第一节 基因工程原理简介 第二节 基因工程中的方法学 基因组序列的选择性扩增—染色体扩增 5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn细胞总RNA或poly(A)RNA 5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn cDNA 3’ NMTTTTTTTTTTTT 简并锚定引物 进行PCR 随机十聚体NNNNNNNNNN———————————— ——————————NMTTTTTTTTTTTT 持续循环 NNNNNNNNNN———————————— ——————————NMTTTTTTTTTTTT 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 样品A 样品B 作Northern探针 作cDNA文库筛选探针 作亚克隆和测序样品 反转录反应 切取目的带,重新扩增,回收纯化 五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定 1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。 2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下 比例：粘端：3~5:1；钝端：6~8:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；α-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定：双脱氧测序法。 六、基因导入技术 （一）细菌 1.氯化钙； 2.电穿孔技术。 （二）细胞 1.脂质体； 2.磷酸钙； 3.电穿孔； 4.显微注射； 5.Virus Vector。 （三）受精卵 1.显微注射； 2.电穿孔技术； 3.精子载体； 4.ESC； 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-V）。 七、常用表达系统 （一）原核表达系统：包涵体；分泌型。 已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。 （二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。 1. 传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等； 2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。 3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品—重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn?）于2006年获准上市。由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业——美国Genzyme转基因公司研制成功。 LA,α-LA, 单抗, 溶菌酶, 牛 Advanced Cell Technology, Genetic GH, INS, HSA 牛 Savings and Clone, Infigen, Pharming ATⅢ,tPA,单抗,GH,α1-抗胰蛋白酶 山羊 Genzyme Transgenics,Nexia Biotechnologies,PPL therapeutics 纤维蛋白原表面蛋白B,原胶原重组抗体 小鼠 Abgenix,Medarex 凝血因子Ⅷ，蛋白C, 血红蛋白 猪 Alexion,Biotransplant, PPLTherapeutics CT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,细胞外SOD, 兔 Pharming, PPLTherapeutics a2-葡糖苷酶,糖原样肽 兔 Pharming, PPLTherapeutics α1-抗胰蛋白酶, 凝血因子Ⅷ,Ⅸ, 绵羊 PPL Therapeutics IGF-1,纤维蛋白原 绵羊 PPL Therapeutics 重组蛋白 动物 生产公司 NATURE Biotechnology, October,2000 表1. 部分已表达的蛋白质 蛋白/肽 公司