第6章真核基因在大肠杆菌中的表达.pptVIP

能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。 来源于pBR322 用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 转译终止密码子 无启动子的galK 原理： 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。 分离功能的启动子： 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上； 将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、 GalK－的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰； 将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆 启动子的筛选 pOK1质粒载体分离功能启动子的因素 1. 选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）； 2. 应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。 3. 采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（ GalE+ GalT+ GalK－）作转化受体； 启动子的构建 -35 区序列 -10 区序列 PlL PrecA Ptrp Plac PtraA Ptac 启动子 T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C A T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体 三、常用的大肠杆菌表达载体 理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，仍保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。 1. 经过HaeⅢ 切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、β-半乳糖苷酶的头8个密码子。有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体 2. 95bp的Alu片断：不完整的CAP结合序列 3. L8突变的203bp区段，在CAP结合序列里发生了G-A的转换 4. 在uv5突变，使lac启动子开始的转录显得更有效。（RNA聚合酶结合区T-A颠换,相邻碱基G-A的转换） 质粒的构建： 将含有lac启动子的HaeⅢ 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoRⅠ切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。 增加2个碱基对 2.Trp启动子的表达载体 这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。 用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。 P1 O trpE 目的基因 1. 大肠杆菌染色体DNA的5.4kb HindⅢ片断，含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。 2. 将此片断，克隆到pBR322质粒的HindⅢ 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个HindⅢ位点）。 构建 3. HindⅢ部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个HindⅢ位点，经核酸外切酶Ⅲ和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1. 使用HindⅢ 接头，将ptrpED5-1质粒的Hinf1片断克隆到了pBR322质粒的HindⅢ 位点上，形成重组质粒pWT111（含有trp调节序列和trpE基因的头7个密码子）。 Trp启动子表达载体已用来生产了α-干扰素和γ-干扰素 三启动子串联单元表达效率高于