第6章人工染色体.pptVIP

第六章 人工染色体 生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与成百至上万千碱基的DNA片段相关。 复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到大片段DNA的研究。 因此，提高载体的容纳量一直是克隆载体的重要发展方向之一。 随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入大片段DNA的克隆载体——人工染色体的研究取得了迅速的发展 所谓人工染色体——是一类能在生物细胞中独立“稳定存在和遗传的人工重组DNA分子”。 酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC，1000kb） 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC，300kb ） 哺乳类人工染色体（MAC） P1衍生人工染色体 酵母自主复制序列（ARS) 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必需的信号。 酵母着丝点 (CEN) 有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。 pYAC4 ：酵母第四条染色体的着丝粒。 ?YAC 载体的选择标记 主要采用营养缺陷型基因 TRP 1：色氨酸生物合成基因缺陷型URA 3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU 2：亮氨酸合成基因缺陷型 SUP 4：赭石突变抑制基因 作用方式：YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。 由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。 YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体 三、YAC克隆系统的特点 1、YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb） 2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC 3、酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境 四、 YAC克隆系统的缺点 首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失 （deletion）和基因重排（rearrangement）的现象。 其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。 YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC载体的广泛应用。 YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。 第二节 细菌人工染色体（BAC） 一、BAC特点 1、是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高通量低拷贝的质粒载体。 2、F因子的特点 又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。 F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞1～2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC中外源基因的重组和嵌合度 带有外源片段的BAC载体在细菌细胞（重组缺陷型，rec－）中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子在细胞内稳定复制而不发生重组，尤其是重复序列多的DNA大分子 克隆350kb 二、BAC载体的结构 1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于100kb的DNA。 解旋酶基因－repE：一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶 选择标志基因Cmr－氯霉素抗性基因 cosN—来源于λphage的cos位点，可以用λ末端酶切割BAC使之线性化 NotⅠ识别序列，位点十分稀少。重组子通过 NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段。 三、BAC优点 BAC载体的容载能力一般为100～350kb 以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建ＢＡＣ文库比ＹＡＣ文库更容易 ＢＡＣ载体以环型超螺旋状态存在，BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。 外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 B