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透射电子显微镜生物制品制备技术 组织学与胚胎学教研室：苏衍萍 冷冻蚀刻法 冷冻割断术 细胞化学法 免疫组织化学技术 免疫电镜法 电镜放射自显影术 放射自显影技术 扫描电镜技术 现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类： 一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法； 另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫电镜法、放射自显影技术、X线微区分析技术等。 1、????? 超薄切片样品的制备 （1）?? 取材 基本要求是在活体情况下进行 取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则） 1）? 快速：1分钟之内投入固定液。 2）?? 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。 3）?? 部位准 4）? 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。 5）??? 低温：0-4oC 取材的方法 1）动物材料： 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。 2）培养细胞： 生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。 3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定 处理后再离心成团， 在50oC中弃去上清液， 加入适量的经50oC 预温的2%的琼浆， 使团悬浮，将悬浮团 和琼脂液一同在薄片 上展层，固定后 切成1mm3的小块。 （2）固定 固定的目地是把细胞在活体状态时的结构尽可能完整的保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或外界微生物的侵入而产生腐败，致细胞的超微结构破坏。 1）固定液的作用 A．阻止细胞自溶。 B 稳定细胞物质成分。 C 在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。 D能提供一定的电子反差 理想的固定剂，应具备以下条件：①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；②能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；③对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；④可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。 2）影响固定效果的因素 固定液的酸碱度(pH值) ①固定液的pH值 ②渗透压 ③缓冲液的类型 ④固定的温度和时间 当前采用的是在0～4℃下固定1 ～ 4小时。 3）常用的几种固定剂 A 四氧化锇（osmium tetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内径相配制。 ?优点①对蛋白质和脂类固定较好。②对作为细胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，对核蛋白保护作用很好，因为在有机体内核酸和碳水化合物与蛋白制成复合的形式，因此锇酸几乎和所有的细胞成分结合。③分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。 缺点①不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。②扩散慢，穿透能力差。③具有挥发性和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。 B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2） 纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。 优点 (1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。 C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。 2）固定的方法 A 单固定法：对单细胞或固定液易于浸透的组织，一般单独用1-2%四氧化锇固定液固定1-2小时可达到固定的目地。 B 双固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）---锇酸（1% 4oC 2h）。 C 原位固定和灌注固定：将动物麻醉、解剖进行原位固定。灌注固定：通过血液循环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神经组织、视网膜、肾脏。 附 几种常见固定剂的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在7.0以下。 0.? 2mol/L磷酸缓冲液的配制 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 29g 重蒸水