人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程.doc

人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程 本品系用狂犬病固定毒（aG）适应株接种原代地鼠肾单层细胞，培养后收获病毒液，加入甲醛溶液灭活后浓缩，再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。 1　毒种 1.1　毒种来源 狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后，再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。生产用毒种传代应不超过10aG交替代。 1.2　毒种检定 1.2.1无菌试验 aG毒种每次传代收剖后均须做无菌试验，合格者方可使用。 1.2.2病毒滴定 aG毒种用体重11～13g小白鼠进行脑内病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。 1.2.3纯毒试验 生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。 1.3　毒种传代 选择体重120～160g健康豚鼠，脑内注射，选潜伏期80～100小时具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑。豚鼠脑连续传代不超过5代。 1.4　毒种保存 供生产用aG株在-60℃以下保存，不得超过1年。 2　疫苗制造 2.1　细胞制备 2.1.1地鼠 选用12～14日龄健康地鼠，如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。 2.1.2解剖 处死地鼠，用消毒液洗涤皮毛数次，末次浸泡一定时间，无菌取肾，置于瓶中剪碎。 2.1.3细胞消化及分装 将剪碎肾块洗涤数次，加入适量胰蛋白酶消化液，置2～8℃过夜（约16～20小时）或37℃水浴消化适当时间，弃去消化液，经洗液洗涤2～3次，振摇或吹打分散细胞，加入适量生长液，分装培养瓶，置37℃±0.5℃培养长成单层。 2.1.4使用液体 均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。 2.1.4.1生长液 为含不超过10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，可加入适量抗生素。 2.1.4.2浸泡液 为水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，其中保护剂可选用0.1%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。 2.1.4.3维持液 为199或其他适宜的溶液，其中保护剂中可选用0.4%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。 2.1.5外源因子检查 每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞（4℃保存不超过7天）进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果；再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。 2.2　病毒接种和病毒液收获 2.2.1病毒接种 将长成单层细胞瓶倾去营养液，换入浸泡液。同时将无菌试验合格的aG株摇碎后，经1000r/min离心10分钟，吸取上清液按1∶1000～1∶4000种入细胞瓶，也可将细胞与病毒同时接种，置32～37℃继续培养。 2.2.2洗换 种毒后吸附适当时间倾去浸泡液，用Hanks液或其他适宜液体洗涤细胞，然后换入维持液，置32～37℃继续培育。 2.2.3病毒液收获 洗换后观察细胞生长情况，选择适当天数收获病毒液，取样品做病毒滴定及无菌试验。 2.2.4病毒滴定 将样品做10倍系列稀释，取3个稀释度的病毒液，每个稀释度用体重11～13g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，14日判定结果，计算LD50（3日内死亡者不计）。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上。可重试1次。 2.3　灭活 病毒液内加入1/4000～1/5000的甲醛溶液，置32～37℃或2～8℃或其他适宜温度灭活一定时间。 2.4　过滤合并 将无菌试验合格的病毒液用滤球或绢布过滤后合并即为原液。 2.5　防腐剂 按0.005%～0.01%加入硫柳汞。 2.6　超滤浓缩 原液按其滴度进行不同倍数浓缩。按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。 3　疫苗剂型 3.1　液体浓缩疫苗 病毒液灭活经超滤浓缩后再加入Al（OH）3，使最终含量为0.4～　0.7mg/ml。 3.2　冻干浓缩疫苗 用适当方法进行超滤或精制，然后冻干。 3.2.1冻干保护剂 1%明胶和5%蔗糖或其他适宜保护剂。 3.2.2疫苗稀释 将保护剂按比例加入疫苗内，充分摇匀，取样做冻干前无菌试验后立即分装与冻干。 4　半成品检定 4.1　无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 4.2　灭活试验 将样品脑内接种体重11～13g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应健存，非特异死亡不超过20%。小白鼠如发病死亡，可继续灭活并进行灭活试验。 4.3　残余牛血清蛋白含量 用检定所认可的试剂