伤寒副伤寒甲二联菌苗制造及检定规程.doc

伤寒副伤寒甲二联菌苗制造及检定规程 本品系用伤寒、副伤寒甲菌培育后取菌苔制成悬液，加甲醛杀菌，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成每ml含伤寒1.5亿菌，副伤寒甲1.5亿菌制成。用于预防伤寒、副伤寒甲。 1　菌种 1.1　菌种来源 制造伤寒、副伤寒甲二联菌苗用的菌种及检定菌种用的诊断血清，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。 1.2菌种检定 检定菌种可用pH7.2～7.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基。 1.2.1培养特性 制造菌苗的菌株应具有的典型的形态、培养和生化特性。 1.2.2血清凝集试验 用37℃培养18～20小时的培养物以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成含菌6亿/ml，与相应的伤寒、副伤寒甲菌诊断血清作定量凝集试验，摇匀后37℃过夜，以肉眼见到凝集（+）之血清最高稀释度为凝集反应之效价。凝集价不应低于血清原效价之半。并用伤寒Vi及O血清做凝集试验，应与Vi血清有凝集，与O血清不凝集，或仅有较低凝集。 1.2.3毒力试验 用37℃培育12～16小时的琼脂培养物以生理盐水稀释，伤寒稀释成6亿/ml、3亿/ml、1.5亿/ml及0.75亿/ml，副伤寒甲稀释成15亿/ml、7.5亿/ml及3.75亿/ml等浓度的菌液（根据菌种毒力情况可作更改也可增加稀释度）。 第一稀释度菌悬液腹腔注射体重14～16g小白鼠至少5只，每只0.5ml，观察3天，使小白鼠于感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个致死量（LD），伤寒菌种1LD应不超过1.5亿菌，副伤寒甲菌种不超过7.5亿菌。 1.2.4毒性试验 用37℃培育18～20小时琼脂培养物混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，56℃加温1小时（或其他方法杀菌），不加防腐剂。杀菌试验合格后稀释成每ml含菌60、30及15亿共3个浓度，每一浓度的菌悬液以0.5ml腹腔注射体重15～18g小白鼠5只，观察3天，注射7.5亿菌之小白鼠应全部生存，注射15亿菌的5只小白鼠可有3只死亡。 1.2.5免疫力试验 按《伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗制造及检定规程》1.2.5项进行。 1.2.6抗原性试验 选体重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力试验所用之菌液静脉注射3次，每次0.5ml，第1次注射7亿菌，第2次14亿菌，第3次21亿菌，每次间隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集试验测定效价。伤寒菌免疫的血清对免疫菌效价应不低于1∶12800，副伤寒甲效价不低于1∶6400，2/3家兔血清之凝集价达上述要求即为合格。 1.3菌种保存 菌种应冻干保存，冻干菌种保存于2～8℃。 菌种冻干后应抽取样品按1.2.2项进行检查，合格后可使用3年。以后每次生产前必须检查全部特性一次，合格者可继续使用2年。 2　菌苗制造 制造伤寒、副伤寒甲二联菌苗所用的每一菌种选用2个菌株。 2.1菌种 冻干菌种启开后检查菌形、纯度及进行玻片凝集试验（伤寒菌加用Vi血清），合格后即可使用。每启开1支冻干菌种用于生产不超过6代。 2.2制造用培养基 用pH7.2～7.4的马丁琼脂或其他适宜的培养基。 2.3原液制造 2.3.1接种 采用涂种，接种后置37℃培育18～24小时。 2.3.2采集 采集前应逐瓶检查，有杂菌者废弃。刮取菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水中。 2.3.3纯菌试验 原液采集后应逐瓶取样接种琼脂斜面1管，于37℃培育2天，24～26℃1天，有杂菌生长应废弃。 2.3.4杀菌 原液用甲醛溶液杀菌，各种原液加入甲醛溶液浓度如下： 伤寒菌原液不超过1.1%±0.1%（ml　/ml）。 副伤寒甲菌原液不超过1.4%±0.1%(ml　/ml)。 加杀菌剂后的原液应放在37℃，不得超过7天，以后保存于2～8℃。 2.3.5无菌试验 纯菌试验合格的原液，应取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基及普通琼脂斜面各1管，放37℃培育5天，有本菌生长，可加倍量复试一次；有杂菌生长应废弃。 2.3.6原液合并 无菌试验合格之原液，安不同菌株或不同制造日期分别过滤合并，合并后应加不超过0.5%(g/ml)的苯酚或其他适宜之防腐剂，保存于2～8℃。 2.4原液检定 2.4.1镜检 菌形应正常，无杂菌。 2.4.2凝集试验 原液与相应血清进行凝集试验，其凝集效价不应低于血清原效价之半。 2.4.3无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 2.4.4浓度测定 应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。 2.4.5免疫力试验 原液于无菌试验合格后与质量检定部门会同进行。抽验批数应不少于生产批数的1/5。方法同1.2.5项，唯所用小白鼠每组至少15只。对伤寒或副伤寒甲毒菌之攻击，均应保护60%小白鼠活存为合格。 2.5原液保存 原液应保存于2～8℃。原液自采集之日起至用于菌苗稀释时不得少于4个月，保存效期自采集之日起为2年半。 2.6菌苗稀释 2.6.1原液配合