冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程.doc

冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程 本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿HYPERLINK \o 书籍相关：瘤 瘤疾病。 1　菌种 1.1菌种来源 基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。 1.2菌种特性 菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。 1.3制造用菌种库的建立 从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。 1.3.1划种LB琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。 1.3.2涂片革兰氏染色 在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。 1.3.3对抗生素的抗性 应与原始菌株相符。 1.3.4电镜检查 应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 1.3.5生化反应 应符合大肠杆菌生物学性状。 1.3.6干扰素的表达量 在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。 1.3.7质粒检查 应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。 1.3.8表达的干扰素型别 应用标准抗α干扰素血清做中和试验，证明型别正确。 1.4生产菌种 从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种。 1.4.1生产菌种的制备及检定 取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2～3块，培养后挑取平板中5～10个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种的表达量。 1.5种子液 从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将1.4.1项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液。 2　发酵培养 2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。 2.2发酵培养基 应为适于发酵培养的培养基，根据菌种的抗生素抗性，培养若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有β椖邗０防嗫股亍?/P 2.3发酵培养参数 根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。 3　收集菌体 用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在?/FONT20℃下保存1年。 4　菌体裂解 用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。 5　制备粗制干扰素 菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。 6　纯化 粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。 7　加白蛋白 取干扰素半成品原液检定合格后，立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT30℃。 8　稀释、除菌过滤 将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量1%～2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。 9　分装、冻干 9.1　每支安瓿分装1ml，内含α2a干扰素100或300万IU。 9.2　冻干过程制品温度不得超过33℃。 9.3　冻干后成品置10℃以下干燥处保存，成品检定合格后进行包装。 10　半成品检定 每批半成品抽样进行10.1～10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9～10.12项检定。 10.1　效价测定 用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为基本检测系统，用国家参考品校准为IU。 10.2　蛋白含量 用Lowry法测定。 10.3　比活性 应≥108Iumg蛋白。 10.4　纯度 10.4.1　电泳纯度 用非还原型SDS?/FONTPAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。 10.4.2　高效液相色谱纯度 用280nm检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。 10.5　分子量 用还原型SDS?/FONTPAGE法，加样量不低于5μg，α2a干扰素分子量应为19KD±10%。 10.6　残余外源性DNA含量 用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。 10.7　残余鼠IgG含量 用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20μg）的鼠IgG含量应在100ng以下。 10.8　残余工程菌蛋白含量 用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。 10.9　残留抗生素活性 半成品中不应有残余抗生素活性存在。 10.10　肽图测定 应符合α2a型干扰素图形，批与批之间图形应一致。 10.11　等电聚集 测定等电点，α2a型干扰素等电点应5.7～6.7范围内。 10.12　紫外光谱扫描 检查半成品的吸收光谱，