蛋白质浓度测定方法研究进展.ppt

Conclusion 2nd priority initiatives 1 2 3 4 5 Evaluate whether offer DT store more margin is possible Together with other strong brands, communicate “Unilever” company brand more Optimize our promotion pack allocation policy Optimize island display in Northern area, pay more attention to season differences Add more POSMs to more outlets. Using multiple ways to communicate with consumers Thanks for your time 紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 蛋白质浓度测定方法 目录 1 经典方法 2 新的方法 3 测定方法的选择 前言 难点 背景 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容 是临床诊断疾病及检查健康情况的重要指标 也是很多生物制品、药物、食品质量检测的重要指标 意义 这些分析方法需要一个合适的标准蛋白或者其组成氨基酸的序列信息以便准确估计目的蛋白浓度 在蛋白质分离纯化过程中，测定蛋白质的浓度是一个很重要的环节，可以帮助人们计算产率、进行物质平衡或测定靶蛋白的特定活力/效力。缺少这一技术的辅助，我么就无法明确得知某种蛋白质的存在，也就无法完成分离提纯的最终目的。 1 经典方法 1.1 凯式定氮法 [原理] 绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右。只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以相应的蛋白质换算系数（均值为6.25、乳制品为6.38），就可以计算出样品中的蛋白质含量。 CuSO4 作催化剂；K2SO4 提高溶液的沸点 消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨 蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中 用标准盐酸溶液进行滴定，记录，计算出样品含氮量 高温条件下强酸(浓H2SO4)把样品中的蛋白质的有机氮全部消化为无机氮形式 1.1 凯氏定氮法——结果计算 只含蛋白质 若测定的样品含氮部分只是蛋白质： 样品中蛋白质含量（%）=总氮量 × 6.25 若样品中尚含有其他含氮物质，则需加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量： 蛋白氮 = 总氮 - 非蛋白氮 蛋白质含量（%）= 蛋白氮 × 6.25 含氮杂质 1.1 凯氏定氮法——三鹿奶粉事件 化学式： C3N6H6 分子量：126 含氮量：66.6% 鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，参入会容易被检测出来 牛奶和奶粉添加三聚氰胺，就是因为它能冒充蛋白质 三聚氰胺 1.2 双缩脲法(Biuret法) [原理] 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 紫色络合物 双缩脲 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 1.2 双缩脲法——操作步骤 绘制标准曲线 测定待测 溶液A540 对照标准曲 线计算浓度 在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。测定范围为1~10mg蛋白质。 试剂(ml)\管号 空白管 1 2 3 4 5 测定管 蛋白标准液（10g/L） - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 - 生理盐水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 - 0.4 待测样品 - - - - - - 0.1 双缩脲试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 相当蛋白质（g/L） 0 10 20 30 40 50 ? 1.3 紫外吸收法 [原理] 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质