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目 录 实验一 蛋白质的吸光分析测定 吸光分析法的原理与仪器 一、 改良Lowry 比色法（Hartree法） 二、 考马斯亮蓝结合法 三、 紫外分光光度法 实验二 酶促反应动力学实验 一、 pH对酶促反应速度的影响 二、 温度对酶促反应速度的影响 三、 底物浓度对酶促反应速度的影响 （碱性磷酸酶Km值的测定） 四、 抑制剂对酶促反应的影响 实验三 氨基酸代谢实验 一、 肝脏谷丙转氨酶活性测定 二、 联合脱氨基作用的检定－等温蒸馏定氨法 实验四 肝糖原实验 肝糖原的提取和定量 饱食、饥饿和激素对肝糖原含量的影响 实验五 细胞培养技术 实验六 细胞与细胞核的分离技术 一、 细胞的分离技术 二、 细胞核的分离与纯化 实验七 真核细胞DNA的提取 实验八 快速抽提质粒 实验九 血清蛋白电泳 一、 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳定量 二、 聚丙酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 三、 血清蛋白质的凝胶等电聚焦电泳 四、 血清脂蛋白琼糖凝胶电泳 实验十 血液成分测定 血液样品的制备 一、 血液葡萄糖测定 二、 血液尿素氮测定-二乙酰一肟法 三、 血清总胆固醇测定 前 言 生物化学的迅速发展，在很大程度上有赖于生物化学实验技术的进步。许多生化理论成果，如果不了解其实验研究过程，是难以得到深刻的理解与牢固的掌握。因此，学生在学习生物化学理论的同时，应该对生物化学实验技术有所了解与掌握。 生物化学实验技术发展很快，种类很多，要在短时间内全面掌握是不现实的。但是学生能对一些常用的基本生化实验方法，通过亲自的操作而有所认识，显然会有助于生化理论的学习与理解。并为将来进一步开展医学研究工作奠定基础。 为此，我们选择了一些常用生化实验方法，供学生操作，其中包括了生化实验技术的各个方面，以定量实验为主，特别注重了医学生化技术的基本原理，希望学生通过这些实验的全过程训练后，能够从多方面理解这些技术的意义及用途，能对这些生化技术有比较全面的认识。随着生物化学的发展，分子生物学实验技术也越来越多地应用到生化的研究领域。我们在本次编写的实验指导中增加了一些分子生物学的实验方法，目的是让学生对分子生物学实验有所了解，同时，对生物化学研究发展方向也有所知晓。 由于受学时数的约束，我们未能把生物化学所有的实验技术都编入其中，只局限于一部分对医学生学习生化可能会有帮助的实验。另外，限于我们业务技术水平等原因，本实验指导可能有一些缺点和不够完善之处，敬请批评、指正。 编者 2007．5 不迟到早退。 不迟到早退。 实验一 蛋白质的吸光分析测定 蛋白质是生物体的主要组成成分，也是生命活动的主要物质基础，体内的酶、受体、凝血因子、免疫球蛋白等都是蛋白质。因此，不论是生物化学、免疫学、药理学、微生物学等医学各基础学科，还是临床检验及临床各科的研究工作，都必须把蛋白质含量测定作为一项基本的实验手段，随着医学科学的不断发展，蛋白质测定方法的应用还会更广。 测定蛋白质含量的方法很多，基本上都是根据蛋白质的物理、化学或者生物学特征而建立的。目前常用的方法主要有根据蛋白质结构或组成的紫外光吸收特征而建立的紫外分光光度法和根据蛋白质与不同试剂起颜色反应或与色素结合，而比色测定其含量的比色法。不论是紫外分光光度法，还是比色法均要使用分光光度计。因此，首先要介绍一下吸光分析的原理与仪器。 吸光分析法的原理与仪器 吸光分析是生化实验中最常用的实验方法。光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长，肉眼可见彩色光称为可见光，波长范围在400ｎｍ～750ｎｍ，小于400ｎｍ的光线称为紫外线，大于750ｎｍ的光线称为红外线。吸光分析所依据的是Lambert和Beer定律。 （一）Lambert定律：一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光的多少与溶液介质厚度有一定比例关系。即： 式中Io为入射光强度。I为通过溶液介质后的光强度，L为溶液介质的厚度，K为吸光系数。 （二）Beer定律：一束单色光通过透明溶液介质时，若溶液介质厚度不变，被吸收光的多少与溶液介质浓度有一定比例关系。即： 式中C为溶液介质的浓度。 上述两式合并可得： 令 则 A=KCL或A= -logT 式中A为吸光度，T为透光度。 此式即为Lambert-Beer定律的物理表示式。其含义为：一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度与厚度成正比。此式即为吸光分析法的基本计算式。 在实际使用分光光度计时，通常是把溶液厚度固定的，因而可直接测定吸光度来求得溶液介质的浓度。平常要测定一个待测样品的同时，常把一个已知浓度的标准品（与待测样品性质相同），配制成不同的浓度，测定其