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Chapter 2. 蛋白质的共价结构 蛋白质（protein）的共价结构即指蛋白质的氨基酸组成及其排列顺序，是蛋白质的一级结构(primary structure)。 2.2 肽 (peptide) 肽（peptide）是氨基酸的氨基和羧基首尾相连形成的链状化合物（少数为环状化合物），肽也被称为肽链。蛋白质区别于多肽的地方在于蛋白质是由一条或多条肽链组成的生物大分子。 多肽的研究在当前的生物化学领域内具有许多重要的理论和现实意义。 血纤蛋白原是一个纤维状大分子蛋白质，有三种类型共六个亚基组成：Aα、Bβ 和γ。凝血酶断裂血纤维蛋白原中央球状区的4个Arg-Gly，从两条Aα、两条Bβ 中各释放出一个A肽和B肽。 A肽和B肽称为血纤肽（fibrinopeptide）。 除去血纤肽的血纤蛋白原被激活，形成血纤蛋白单体（fibrin monomer），其亚基为（α β γ）2，能自发地聚集呈有序的纤维状排列，呈血纤蛋白（fibrin）. 血纤肽由于含有很大的负电荷，组织血纤蛋白聚集，起着稳定血纤蛋白原的作用。 血纤蛋白溶解系统 2.5 肽和蛋白质的人工合成 一、肽的人工合成 非反应性活泼基团的保护 液相肽合成法 液相肽合成方法比较多。一般来说，要根据具体的肽的氨基酸组成采取合适的侧链保护与脱保护方法，采取适当的肽缩合方法。肽的缩合有四种方法： （1） DCC缩合法。DCC即二环己基碳二亚胺（N,N’－dicyclohexylcarbodiimide）, 这是当前使用最为频繁的一种肽缩合方法，反应结束后，DCC变成不溶性的DCU（N,N’-二环己基脲，N,N’-dicyclohexylurea）。反应式如下； （2）活化酯法(activated ester), 从氨基端开始肽链向羧基端衍生的合成方法。氨基端的保护氨基酸的羧酸被合成活化酯后与下一个氨基酸反应。活化酯通常是指对硝基苯酚酯（ONp）、还有比较好用的N-羟基琥珀酰亚胺酯（HOSu）等。活泼酯法有一个优点就是羧基端氨基酸或肽的有些侧链不需要保护。 （3）混合酸酐法（mixed anhydrous）从羧基端向氨基端方向合成肽链。反应速度快，产率高，易消旋。 （4）叠氮法（azide）这是由小肽缩合成大肽时常用的方法。 二、胰岛素的人工合成 三、固相合成 固相肽合成（solid-phase peptide synthesis, SPPS）。 是把第一个氨基酸的羧基端连接到树脂上（通常用的是聚苯乙烯树脂），从C端向N端延生合成肽链。常用的缩合方法是DCC缩合法。现在，整个合成过程都能够在固相合成仪上进行。常用的羧基保护基是Boc，但现在更加倾向于用Fmoc保护基。肽合成之后，用HF切割就可以把合成的肽段从树脂上释放出来。 芴甲氧基甲酰基 2. 还原法 用LiBH4还原羧基端氨基酸为α-氨基醇，再通过水解后提取该α-氨基醇后即可以分析得知其类型。 3. 羧肽酶（carboxypeptidase）法，C－末端残基最有效的测定方法。羧肽酶为外肽酶，专一性地从羧基端逐个降解并释放出游离的氨基酸。 常用的有四种羧肽酶：A、B、C和Y。A释放除Pro、Arg和Lys之外所有的羧基末端氨基酸；B只能水解Arg和Lys为羧基末端的氨基酸；Y能释放任何一种C末端氨基酸。 2.3.3 二硫桥键的断裂 氧化剂和还原剂都可以打开S-S键。氧化剂常用的是过甲酸氧化法；还原法常用巯基乙醇法。 在断裂S-S键的过程中必须使蛋白质变性，因此要加入8 mol/L的尿素或6 mol/L的盐酸胍。 2.3.4 氨基酸组成的分析 现在一般用氨基酸组分分析仪完成该工作。 一般用6 mol/L的盐酸在110 oC水解10~24 h，水解后除去盐酸。要辅以碱水解测定Trp的含量。 水解中氨基酸的破坏程度与保温时间呈线性关系。 蛋白质的氨基酸组成一般用每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示，或用每100 g蛋白质中含氨基酸的克数表示。 2.3.5 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 目前最常用也最有效的方法是Edman化学裂解法，但只能降解较短的肽段。必须裂解长肽为短肽。 选用专一性强的水解酶类或化学试剂。要求是：裂解点少、专一性强、反应产率高。 一、酶裂解法：用蛋白酶（protease）水解,常用的蛋白水解酶有—胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等。这些酶不同于氨肽酶和羧肽酶，都是肽链内切酶，叫内肽酶（endopeptidase）。 胰蛋白酶（trypsin）最常用的蛋白水解酶，专一性强，断裂Lys或Arg残基羧基参与形成的肽键。产生的肽段数目等与Arg和Lys总数加1。 糜蛋白酶（chymotrypsin），断裂Phe、Trp和Tyr芳香氨基酸残基的羧基端肽键。