专题三核酸电泳技术.pptVIP

专题二 核酸电泳技术 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。 琼脂糖凝胶的分离范围很大。 50bp到百万bp长的DNA都可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶中分离。小片段DNA(50～20 000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。在这些条件下，DNA泳动速率通常随DNA片段长度的增加而减少，但与电场强度成正比。然而这一简明的相关性当DNA片段长度超过一个最大极限值时立即被破坏，这种情况主要是由于凝胶的构成和电场强度决定的。当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就达到它分辨率的极限。此时，DNA不再被凝胶按其大小筛分，而必须以一端在前的方式在介质中迁移，就像通过曲折而又空间有限的管子。这种迁移模式称作“蠕行” 。 聚丙烯酰胺凝胶最适合分离小片段DNA(5—500bp)。它的分辨率非常强，长度上相差1bp或质量上相差0.1％的DNA都可以彼此分离。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是